罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

雷 燕，肖 洋，赵振峰，唐绍林，黎建斌，陈福艳



罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

雷 燕1,2，肖 洋1,2，赵振峰1,2，唐绍林1,2，黎建斌3，陈福艳3

（1. 广州利洋水产科技股份有限公司，广东 广州 510515；2. 广州金水动物保健品有限公司，广东 广州 510515；3. 广西水产科学研究院 广西遗传育种与健康养殖遗传重点试验室，广西 南宁 530021）

【】建立快速检测罗非鱼罗湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）的RT-PCR方法。【】参照GenBank中罗非鱼罗湖病毒全基因序列，依据其假定蛋白基因片段3设计合成1对特异性扩增引物，提取罗湖病毒RNA，逆转录成cDNA，进行PCR扩增，通过优化扩增条件和扩增体系，建立快速检测罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR方法。用该方法对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼样品进行RT-PCR扩增。【】RT-PCR扩增得到与试验设计相符的499 bp的特异性目的条带，而对健康罗非鱼、野生罗非鱼及其他病毒对照组的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明，该方法检测结果准确，最低可检测出约10 fg/mL的质粒DNA，具有较好的特异性和较高的敏感性。用该方法对332份临床样品进行RT-PCR检测，其中36份样品扩增出特异性的目的条带，经测序比对，检测结果正确。【】建立的检测方法可用于TiLV的检测。

罗非鱼；罗湖病毒；快速检测；RT-PCR

罗非鱼罗湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV），是近年来发现并报道的一种新病毒，最早于2009年在以色列被检测到[1-2]，已相继在以色列[3]、哥伦比亚[4]、厄瓜多尔[4]、埃及[5]和泰国[6]发现。该病原体虽不会引起公共卫生问题，但可导致受感染种群大量死亡。据报道，该病毒传染性较强，已造成以色列、厄瓜多尔、哥伦比亚等养殖罗非鱼大面积死亡，死亡率高达80% ~ 90%，在埃及则造成5% ~ 15%的死亡[6]。据联合国粮农组织发布的消息，TiLV可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁，目前已引起多个国家的重视。

TiLV是一种负链RNA病毒，基因组由10个独立的基因片段组成，目前仍未确定其分类地位，极可能是正黏病毒科一种新型病毒[6]。其适宜生长温度为24 ~ 33 ℃，最适生长温度25 ℃[2]。目前尚无针对性疫苗和有效治疗措施报道。2017年5月，本课题组首次从国内养殖的罗非鱼中检测出该病毒[7]。目前，罗湖病毒检测仅见巢式PCR检测方法[8]。本研究依据TiLV的假定蛋白（Hypothetical protein）基因segment 3的基因序列，建立针对TiLV的RT-PCR检测方法，为其临床对该病的诊断提供一种快速、敏感、准确的技术手段，有利于TiLV早期感染阶段的检测和流行病学的调查。

1 材料和方法

1.1 实验用鱼

TiLV阳性材料采自海南省文昌市潭牛镇某罗非鱼养殖池塘，由广州利洋水产科技股份有限公司水产动物疾控中心实验室（下称“本实验室”）收集、PCR扩增和测序鉴定并保存。野生未发病罗非鱼样品采集自广东省珠海市，养殖未发病罗非鱼采自广东省广州市。

1.2 实验用毒株

锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）、鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）、真鲷虹彩病毒（Red-sea bream iridovirus，RSIV）、传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）的DNA和草鱼出血病病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）、神经坏死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）的cDNA均由本实验室收集、保存。临床样品分别采自海南、广东、云南、广西等地罗非鱼养殖池塘，计332份。

1.3 主要试剂

2×Taq PCR MasterMix、大肠杆菌（）DH5α感受态细胞、高纯度质粒小提试剂盒、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。DNA分子标准DL2000、pMD19-T载体、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit等购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank中TiLV分离株Til-4-2011的假定蛋白基因segment 3的基因序列（GenBank登录号：KU751816），应用DNAStar 5.0和Oligo6.0软件设计1对特异性引物，预期扩增目的基因片段长度为499 bp。正向引物F：5′-GAATAATAAAGT GAGCTTAAG-3′，反向引物R：5′-CAGGGAAAG TACTGCATAGCG-3′。引物由华大基因（广州）科技股份有限公司合成。

1.5 病毒RNA的提取

分别取TiLV阳性罗非鱼的鳃、肝脏、脾脏、肾脏等组织100 mg，加入600 µL灭菌ddH2O，用玻璃匀浆器充分匀浆研磨，于-80℃至室温反复冻融3次，将组织匀浆液以12 000 r/min、4 ℃条件离心10 min，取上清液400 μL，加入RNAiso Plus 400 μL，充分振荡，室温下静置5 min。加入氯仿120 μL，用力振荡10 s，室温下静置10 min，以4 ℃、12 000 r/min条件离心10 min，取上清液，加入等体积异丙醇充分混匀，静置15 min，以4 ℃、12 000 r/min条件离心15 min。弃上清液，加入1 mL -20 ℃下预冷的体积分数75%乙醇，充分混匀，以4 ℃、12 000 r/min条件离心5 min，弃上清液，于室温下干燥10 min，加入DEPC处理水60 μL溶解，- 80℃下保存。野生未发病罗非鱼、养殖未发病罗非鱼及待检发病罗非鱼样品同法抽提RNA。

1.6 RT-PCR检测方法的建立

逆转录（RT）反应体系（10 μL）：1 µg/mL RNA 模板7 μL，5×PrimeScriptBuffer 2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL。反应程序：于37 ℃下逆转录反应15 min，85 ℃下灭活逆转录酶5 s，4 ℃下保存，得cDNA产物。

PCR扩增体系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL、灭菌ddH2O 6 μL、cDNA模板3 μL和10 mmol/L上下游引物各0.5 μL。反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。结果用12 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 阳性重组质粒的构建

PCR产物经回收试剂盒纯化回收，与pMD19-T 载体连接后转化至DH5α感受态细胞。在含氨苄青霉素的培养板上，于37℃下培养12～16 h，挑取单个菌落，增菌后用小量质粒抽提试剂盒提取质粒进行PCR分析鉴定，筛选出阳性重组质粒送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.8 PCR反应体系和反应条件的优化

分别用宝生物公司的DNA聚合酶试剂盒及天根的PCR预混液优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、酶浓度等指标，发现Mg2+浓度、dNTPs浓度、酶浓度等指标对实验结果几无影响；因此，反应体系仅优化引物浓度和模板浓度指标。

10 mmol/L上下游引物分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μL，PCR产物电泳后确定引物浓度。

模版分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，PCR产物电泳后确定模板浓度。

分别以45.0、46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8、65.0 ℃作为退火温度进行PCR，产物电泳后确定退火温度。

1.9 RT-PCR特异性试验

应用建立的RT-PCR方法分别对自然感染TiLV发病的罗非鱼、健康罗非鱼、野生罗非鱼、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV的DNA和cDNA进行检测，验证该方法的特异性。

1.10 RT-PCR敏感性试验

测定构建的pMD19-CMNV质粒浓度，将重组质粒稀释成1 ng/mL，再进行10倍梯度稀释，以各浓度梯度的质粒作为模板，取1 μL进行PCR检测，验证该方法的敏感性。

1.11 临床样品检测试验

应用本研究建立的罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR检测方法，对来自海南、广东、云南、福建、广西、江苏、天津等地的332份临床样品进行检测，将检出的阳性样本RT-PCR扩增产物送华大基因（广州）科技股份有限公司进行测序，进一步验证该方法的准确性和特异性。

2 结果

2.1 RT-PCR检测方法的建立

利用临床收集的罗非鱼罗湖病毒阳性材料，设计合成特异性检测引物，建立针对罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR检测方法，该方法可从罗非鱼罗湖病毒阳性材料中扩增出片段长度与实验设计相符的目的条带（图1）。

M：DNA分子标准DL2000；1：阴性对照；2：扩增产物

2.2 阳性重组质粒的构建

阳性目的条带经纯化回收，与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞。经筛选培养增菌后，用小量质粒抽提试剂盒提取质粒进行PCR鉴定，将此阳性克隆通过正反两端2次测序获得499 bp的序列，与GenBank中发布的罗非鱼罗湖病毒基因序列（GenBank登录号：KU751816）的同源性为99.6%。

2.3 PCR反应体系和反应条件的优化

比较不同浓度的引物、不同的模板浓度以及不同的退火温度条件下PCR结果（图2），确定反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，灭菌ddH2O 7 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL；反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共30次循环；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存。

2.4 RT-PCR特异性扩增结果

对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼、健康罗非鱼、野生罗非鱼、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV的DNA和cDNA的扩增结果显示，仅自然感染TiLV发病的罗非鱼扩增出499 bp的特异性目的条带，而野生罗非鱼、健康罗非鱼及其他对照组均未扩增出任何条带（图3），表明该方法有较强的特异性。

M：DL2000 DNA分子标准；1-8：引物用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 μL；9-16：模板用量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL ；17-24：退火温度设为45.0、46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8、65.0 ℃

M：DNA分子标准DL2000；1：自然感染TiLV发病罗非鱼；2：健康罗非鱼；3：野生罗非鱼；4：KHV；5：CyHV-2；6：RSIV；7：ISKNV；8：GCRV；9：SVCV；10：VNNV

2.5 RT-PCR敏感性扩增结果

将原始浓度为1 ng/mL的重组质粒DNA稀释10-5倍时，仍可扩增出清晰的目的条带，即该PCR检测方法最低能检出10 fg/mL的pMD19-TiLV质粒模板（图4）。

M：DNA 分子标准；1-7：1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL, 100 fg/mL, 10 fg/mL, 1 fg/mL 的pMD19-TiLV质粒

2.6 临床样品的检测和测序分析

应用建立的罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法对332份临床样品进行检测，检出36份罗湖病毒阳性样品（表1），经序列测定、比对，从自然发病罗非鱼阳性材料中扩增的目的条带基因序列与GenBank中罗湖病毒的基因序列同源性高达99.6%，进一步证实该检测方法的准确性和特异性。

表1 不同地区临床罗非鱼样品TiLV的RT-PCR检测结果

3 讨论

罗非鱼为联合国粮农组织（FAO）向全世界推广养殖的优良鱼种之一，其养殖已遍布多个国家和地区[9]。我国罗非鱼养殖产量自2000年一直占世界罗非鱼养殖总产量的50%以上[10]。近年来，随着我国罗非鱼养殖规模扩大，各种传染性疾病呈现不断增长的趋势，危害罗非鱼的主要传染病有链球菌病[11-13]、细菌性败血症等[14-17]。2016年，Eran等[18]报道一种新型的致命病毒——罗湖病毒造成以色列、厄瓜多尔、埃及等国的养殖罗非鱼大面积死亡。

本研究建立针对TiLV假定蛋白基因segment 3的RT-PCR检测方法。最低检出限为10 fg/mL重组质粒DNA，说明建立检测方法有较高的敏感性。

本研究方法仅对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼检测出罗湖病毒，而对健康罗非鱼、野生罗非鱼、KHV、CyHV-2、RSIV、ISKNV、GCRV、SVCV、NNV均未检出，说明所建立的RT-PCR检测方法有很高的特异性。

目前对于TiLV的检测，未见其他有效方法，Dong等[8]和Kembou等[19]建立了TiLV的巢式PCR检测法，但该方法检测步骤繁琐，耗时长，不利于临床样品快速检测要求。本研究建立的TiLV的RT-PCR检测方法，可以特异、快速地检测临床样品，可在3 h内完成检测，且可对大量样品进行检测，这对罗湖病毒的早期诊断以及大量临床样品的检测有重要意义。

综上，本研究建立的罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法在对罗非鱼样品进行检测时有较强的特异性和较高的敏感性，可快速地对大量临床样品进行检测，适用于临床样本的批量检测和罗湖病毒的流行病学监测。

[1] FERGUSON H W, KABUUSU R, BELTRAN S, et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia,(L.): a case report[J]. J Fish Dis, 2014, 37: 583-589．

[2] EYNGOR M, ZAMOSTIANO R, KEMBOU TSOFACK J E, et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52: 4137-4146．

[3] BACHARACH E, MISHRA N, BRIESE T, et al. Characterization of a novel rthomyxo-like virus causing mass die-offs of tilapia[J]. MBio, 2016, 7: e00431-00416．

[4] DEL-POZO J, MISHRA N, KABUUSU R, et al. Syncytial hepatitis of tilapia (L.) is associated with Orthomyxovirus-like virions in hepatocytes[J]. Vet Pathol, 2017, 54: 164-170．

[5] FATHI M, DICKSON C, DICKSON M, et al. Identification of tilapia lake virus in Egypt in Nile tilapia affected by “summer mortality” syndrome[J]. Aquaculture, 2017, 473: 430-432．

[6] DONG H T, SIRIROOB S, MEEMETTA W, et al. A warning and an improved PCR detection method for tilapia lake virus (TiLV) disease in Thai tilapia farms. https://www.researchgate.net/publication/316283907.

[7] 雷燕, 赵振峰, 李海涛．池塘养殖发病罗非鱼检出罗湖病毒.http://bbs.liyang-tech.com/forum.php?mod=view thread&tid=14932&highlight=%C2%DE%BA%FE%B2%A1%B6%BE&_dsign=01c74355.

[8] DONG H T, SIRIROOB S, MEEMETTA W, et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection[J]. Aquaculture, 2017, 476: 111-118．

[9] 王玮，丁建乐，房金岑．罗非鱼产业标准化现状及分析[J]. 上海海洋大学学报，2012，21（6）：976-981．

[10] 杨弘．中国罗非鱼产业发展趋势与建议[J]．海洋与渔业，2010（5）：33-34．

[11] 卢迈新．罗非鱼链球菌病研究进展[J]．南方水产，2010，6（1）：75-79．

[12] 王民权，葛朋彪．罗非鱼主要病害控制技术[J]. 中国水产，2006(7)：57．

[13] 郭玉娟，张德锋，樊海平，等．中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究[J]．水产学报，2012，36（3）：399-405．

[14] 杨宁，黄海，张希，等．尼罗罗非鱼嗜水气单胞菌病的病原分离鉴定和药敏试验[J]．水产科学，2014，33(5): 306-310．

[15] 陈善真，潘忠超，段元慧，等．一株尼罗罗非鱼致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 广东农业科学，2014(7): 158-161．

[16] 李聪，蔡岩，周永灿，等．海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究[J]．水产科学，2015，34(10): 640-646．

[17] 韦阳道，杨军，文衍红，等．罗非鱼竖鳞病病原维氏气单胞菌的分离鉴定与致病性研究[J]．中国畜牧兽医，2016，43(11)：3047-3052．

[18]ERAN B, NISCHAY M, THOMAS B, et al. Characterization of a novel orthomyxo-like virus causing mass die-offs of Tilapia[J]. American Society for Microbiology, 2016, 7(2): 1-7．

[19] KEMBOU TSOFACK J E, ZAMOSTIANO R, WATTED S, et al. Detection of Tilapia lake virus in clinical samples by culturing and nested reverse transcription-PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2017, 55(3): 759．

Development and Application of a RT-PCR Assay of Tilapia Lake Virus

LEI Yan1,2, XIAO Yang1,2, ZHAO Zhen-feng1,2, TANG Shao-lin1,2, LI Jian-bin3, CHEN Fu-yan3

（1.,510515,; 2.,510515,; 3.,,530021,）

【】To establish a method for rapidly detecting tilapia lake virus (TiLV) byRT-PCR. 【】A pair of specific primers were designed according to the complete genome hypothetical protein segment 3 of a novel RNA virus, called TiLV, and RNA of TiLV was extracted and reversely transcribed to cDNA as template for PCR. A rapid RT-PCR method was established for detection ofTiLV by optimization of the reaction parametersAnd the Tilapia whichnaturally infected with TiLV was detected by the RT-PCR method. 【】The specific band of 499 bp was amplified from the positive sample, but no specific band was found from healthy tilapia, wild tilapia and other control. Sequencing analysis indicated that this method was accurate, and 10 fg/mL DNA plasmid of the TiLV could be detected. 332 clinical samples were collected and 36 of those were positive, and the detection result was verified by sequencing and sequence alignment.【】 The findings indicated that the RT-PCR assay could be used for the detection of TiLV. The established RT-PCR assay could lay the foundation for the detection and epidemiological investigation of TiLV infection.

Tilapia; Tilapia Lake Virus; rapid detection; RT-PCR

S943.125.41

A

1673-9159（2019）03-0001-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.001

2017-06-27

广西科技重大专项（桂科AA17204081-5）；国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设专项资金（nycytxgxcxtd-08-02）

雷燕（1983—），男，硕士，研究方向为养殖水产动物病害防治。E-mail: leikunnuy@163.com

陈福艳（1979—），女，副研究员，研究方向为水生动物病害与防治。E-mail: 215174469@qq.com

雷燕，肖洋，赵振峰，等. 罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 广东海洋大学学报, 2019, 39(3): 1-5.

（责任编辑：刘庆颖）