补肾强督方对骨髓间充质干细胞成骨过程Wnt通路中因子表达的影响

李艳萍 ，杨文雪 ，夏启胜 ，阎小萍 ，陶庆文 ，陈志华 ，赵淑欣 ，孔维萍 ⋆

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.天津市中医药研究院肾病科，天津 300120；3.中日友好临床医学研究所，北京100029；4.中日友好医院 中医风湿病科，北京 100029；5.免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种原因不明的慢性、炎性、自身免疫性疾病。主要累及骶髂、脊柱及外周关节，并可伴发关节外表现。附着点炎症、骨侵蚀、韧带骨赘形成被认为是AS的主要病理过程。其中病理性新骨形成是其独特标志[1]。新骨形成导致的不可逆结构损伤在疾病后期严重影响了脊柱活动，使关节活动降低[2]。晚期可出现脊柱活动受限、僵硬、融合，关节屈曲挛缩、畸形，造成患者不同程度残疾，严重影响了疾病预后。

目前较为统一的观点认为骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）原生质膜的受体上结合 Wnt蛋白，诱导其向成骨细胞分化，成骨细胞产生骨基质沉积而成骨[3]。现已证实经典Wnt信号通路（β-catenin依赖性通路）在BMSCs成骨过程发挥了重要作用[4]，该通路的激活促进成骨细胞分化和成熟，并与AS的新骨形成相关[5]。本实验拟观察补肾强督方含药血清对Wnt信号通路中因子表达的影响，探讨补肾强督方抑制新骨形成的可能作用机制。阳性对照药物选择非甾体抗炎药塞来昔布。有研究报道连续使用其可减低AS放射学进展[6]。在细胞实验方面有研究发现在炎症条件下，大剂量塞来昔布的治疗可以抑制BMSCs的成骨[7]。但目前关于塞来昔布对于AS的Wnt通路影响研究还未见报道。

1 材料与方法

1.1 制备药物补肾强督方和西药对照溶液

补肾强督方组成:熟地、金狗脊、鹿角、骨碎补、补骨脂 、桂枝、赤芍 、白芍 、知母 、秦艽 、羌活等。中日友好医院药剂室煎制，药物经水煎、过滤、浓缩至终浓度分别为0.75、1.5、3g/ml的补肾强督方低、中、高剂量组各140ml，装瓶，封盖，灭菌，4℃冰箱保存备用。西药对照药:塞来昔布胶囊（西乐葆），厂家:上海辉瑞制药有限公司，批号:R55875，规格:0.2g/片。换算为大鼠等效剂量，用水溶解，4℃冰箱保存备用。

1.2 大鼠含药血清制备

实验动物选用 Wistar雄性大鼠（来源于维通利华）20只，随机分为5组（每组4只）:中药高、中、低剂量组、西药对照组以及空白组，分别进行灌胃给药，连续给药 7d，灌胃剂量参照《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》。末次给药 2次，间隔 1h，末次给药前 12h，禁食不禁水，末次给药后 1h大鼠称重，平均220g/只，10%水合氯醛（中日医院提供）麻醉，每只1.2ml，剖腹，腹主动脉取血，离心取血清，56℃灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存。

1.3 细胞传代扩增培养

人BMSCs购自ATCC，在MSCM基础培养基（含1%青霉素链霉素双抗、5%胎牛血清、1%间充质干细胞生长因子，均购自ATCC）内培养，细胞密度为3×105/ml，接种于 2μg/cm2多聚赖氨酸（购自Sciencell）包被后的 T-25培养瓶中，置 37℃温箱静置培养，次日更换培养液继续培养，观察生长情况。待细胞铺满培养瓶 60%～70%时，用0.25%胰酶（购自Gibco）进行消化，收集细胞后离心并台盼蓝计数，后将细胞种于3个2μg/cm2多聚赖氨酸包被后T-25培养瓶中，置37℃温箱静置培养，次日更换培养液继续培养，观察生长情况，传代扩增至第5代的细胞用于实验。

1.4 细胞成骨分化培养干预

用多聚赖氨酸包被好六孔板后，对第5代人BMSCs进行台盼蓝计数，调整细胞密度，接种于包被好的六孔板中，使得每孔中含约1×105个人BMSCs细胞，补足培养液至每孔2.5ml。置37℃温箱静置培养，次日更换培养液继续培养，观察生长情况，直至细胞铺满六孔板，分为中药高、中、低剂量组、西药对照、空白组。各分化组吸弃各孔中的培养基，分别更换为加入对应含药血清的MODM（含1%青霉素链霉素双抗、5%胎牛血清、1%间充质干细胞成骨分化因子、20%含药血清）2.5ml，进行药物干预成骨分化，4～5d更换1次培养液，培养14d。

1.5 检测指标

实时荧光定量PCR测定BMSCs膜内成骨中GSK3β、wnt5a和SOST mRNA 表达:BMSCs诱导成骨分化 14d，Trizol（购自Invitrogen）提取成骨细胞总RNA。取1μg总RNA，用逆转录试剂盒（购自BIO-RAD）合成20μl cDNA，再取1μl cDNA进行实时荧光定量PCR反应。GSK3βmRNA上游引物为:5'-CACGGTCTCCAGTATTAGCATCT-3'，下游:5'-GGCTACCATCCTTATTCCTCC-3'；Wnt5a mRNA上游引物为:5'-TGGTGGTCGCTAGGTATGAATAAC-3'，下游:5'-TCCTGATACAAGTGGCACAGTTTCT-3'，SOST mRNA上游引物为:5'-CGGTCCCGAAGTCCTTGAGCT-3'，下游:5'-GGCAAGTGGTGGCGACCTAGT-3'。引物均由捷瑞生物工程有限公司合成，以cDNA为模板按FastStartUniversalSYBRGreenMaster（ROX）试剂盒（购自 Roche）说明书配制 25μl的PCR反应体系，按以下条件在AB7500（Thermo公司）进行扩增:预变性，1个循环，95℃ 2min；热循环，40个循环，95℃ 15s，60℃ 1 min；溶解曲线。每种样品做3个复孔，计算时取平均值。

1.6 检测方法

免疫印迹法分析BMSCs中 GSK3β、wnt5a和SOST蛋白含量:BMSCs诱导成骨分化14d后用RIPA法提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）检测细胞中的目标蛋白质含量。样品加入上样缓冲液后100℃加热 5min。每孔各上 15～20μg样品蛋白。电泳后，蛋白转印至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭，37℃，2h，孵育一抗（GSK3β、SOST、Wnt5a，均购自 AB-cam），均为1∶1000稀释，4℃ 孵育过夜后用TBST充分洗涤。孵育二抗（KPL公司，货号:074-1516），室温孵育 2h，ECL发光试剂盒（购自Millipore）显影，以β-actin为内对照，拍照，对杂交带进行密度扫描分析，比较蛋白的相对表达。

1.7 统计学方法

采用SAS9.2统计学软件，对各组数据进行正态分布检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐采用方差分析，方差不齐的资料采用Wilcoxon秩和检验。

2 结果

2.1 补肾强督方干预BMSCs成骨的结果

如图1（见封二）所示，空白组骨髓间充质干细胞成骨分化培养14d后可见明显矿化结节形成，补肾强督方高、中、低剂量组及西药对照组均未见明显矿化结节，各组间无明显差别。提示补肾强督方和塞来昔布均可抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。

图1 各组骨髓间充质干细胞成骨诱导结果（茜红素染色×10）

2.2 含药血清对BMSCs成骨分化 SOST、Wnt5a、GSK3βmRNA表达的影响

如图2所示，①各组细胞SOST mRNA表达:与空白对照组比较，中药各剂量组和西药组SOST mRNA表达水平显著增高（P＜0.05）；与西药组比较，中药高、中剂量组表达升高（P＜0.05）；与中药低剂量组比较，中药高、中剂量组表达升高（P＜0.05）；与中药中剂量组比较，中药高剂量组表达升高（P＜0.05）。②各组细胞 wnt5a mRNA 表达:与空白对照组比较，中药高中低剂量组wnt5a mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与西药对照组比较，中药中高剂量组wnt5a mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与中药低剂量组比较，中药高剂量组wnt5a mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。③各组细胞GSK3β mRNA表达:与空白对照组比较，中药各剂量组GSK3β mRNA表达水平显著增高（P＜0.05）；与西药对照组比较，中药中、高剂量组 GSK3β mRNA 表达水平显著增高（P＜0.05）；与中药中、低剂量组比较，中药高剂量组GSK3β mRNA 表达水平显著增高（P＜0.05）。

2.3 含药血清对BMSCs成骨分化中SOST、Wnt5a、GSK3β蛋白表达的影响

如图3所示:①与空白对照组比较，中药各剂量组、西药对照组SOST蛋白质产生量显著增高（P＜0.05），与西药对照组、中药低剂量组比较，中药高剂量SOST蛋白质产生量显著增高（P＜0.05）。②与空白对照组比较，中药高剂量组、西药组Wnt5a 蛋白质产生量显著降低（P＜0.05），与西药对照组比较，中药高剂量Wnt5a蛋白质产生量显著增高（P＜0.05）。③与空白对照组比较，中药高剂量组GSK3β蛋白质产生量显著增高（P＜0.05），与西药对照组、中药低剂量组比较，中药高剂量GSK3β蛋白质产生量显著增高（P＜0.05）。

3 讨论

图2 补肾强督方对 BMSCs成骨分化中SOST mRNA、Wnt5a mRNA及GSK3β mRNA表达的影响

新骨形成是AS目前研究的热点，AS新骨形成部位多在连接骨的肌腱、韧带处[8]，可在疾病后期导致强直，严重影响脊柱活动度，甚至造成残疾，是影响本病预后的主要原因。近年来，Wnt信号通路在AS新骨形成中的作用引起广泛关注，该通路的激活促进成骨细胞分化和成熟，与AS的新骨形成相关[5]。

SOST是Wnt通路的抑制剂，当Wnt蛋白与卷曲受体和LRP5/6受体结合时，激活一系列信号级联反应，发生经典的Wnt/β-catenin信号通路，而SOST可竞争性结合LRP5/6共同受体，从而抑制Wnt信号通路[11]。AS患者血清SOST水平较正常人对照组显著降低[16～19]，AS患者关节免疫组化染色SOST的表达显著降低于健康对照组[21]。Wnt5a是一种既参与经典Wnt信号通路，又参与非经典Wnt信号通路的Wnt蛋白，不仅具有调节成骨细胞的功能[12～14]，还能促进BMSCs表达ALP，促进其骨化进展[20]。抑制Wnt5a可减少成骨细胞矿化[22]。另外，在经典 Wnt通路中，APC、GSK3β、Axin组成了β-catenin降解复合物，使细胞内βcatenin水平降低，抑制了经典的Wnt/β-catenin信号通路[15]。很多研究表明抑制GSK3β可促进骨形成。有研究表明通过基因敲除或药物抑制GSK3β可增加骨密度[9]。在本实验中，结果显示，与空白对照组比较，补肾强督方含药血清可以促进 BMSCs中 SOST、GSK3β蛋白的表达，抑制wnt5a蛋白的表达（P＜0.05）。实时荧光定量PCR检测各组mRNA表达显示，与空白对照组比较，补肾强督方含药血清可以促进BMSCs中SOST、GSK3β mRNA的表达，抑制wnt5a mRNA的表达（P＜0.05）。

图3 补肾强督方对 BMSCs成骨分化中SOST、Wnt5a及GSK3β蛋白表达的影响

我们认为AS（大偻）主要病因病机是因肾督亏虚、阳气不足，风寒湿邪（尤其是寒湿偏重者）深侵肾督，阳失布化，阴失营荣，骨损筋挛，脊柱僵曲所致[10]。认为附着点、滑膜关节、软骨结合处的新骨生成是AS筋骨的生长发育逆乱的一种外在表现，其本质是由于邪气深侵入肾督，精血亏虚，筋骨失养而导致的。据此提出AS治疗原则应以补肾强督为大法，辅以祛寒除湿、散风活瘀、强壮筋骨，通利关节等治疗原则，研制出经验处方补肾强督方，主治强直性脊柱炎（大偻）肾虚督寒证。方药由熟地、金狗脊、鹿角、骨碎补、补骨脂、桂枝、赤芍、白芍、知母、秦艽、羌活等组成，通过补肾精，养肝血，充骨髓，荣筋脉，促进筋、骨恢复正常生长发育。

前期我们对补肾强督方能否抑制AS的新骨形成进行了探索性研究，结果证实:补肾强督方能够抑制AS附着点、滑膜关节、软骨结合处的新骨形成，应用本方治疗2年后AS患者新骨形成放射学评分（mSASSS）较治疗前无显著增加。此外我们发现本方含药血清能促进BMSCs成骨分化中DKK1蛋白和mRNA表达，抑制β-catenin蛋白和mRNA表达，且呈剂量依赖性，提示补肾强督方能调节BMSCs细胞成骨分化中Wnt通路[23]。我们还发现本方能够抑制自发性AS模型DBA/1小鼠成骨分化中Wnt通路的激活，上调DKK-1水平，下调wnt5a水平，而临床研究亦提示该方能上调AS患者血清中DKK-1水平，这些均提示该方可能通过Wnt通路抑制AS异位骨化[24]。

本研究是对系列研究的进一步补充，结果提示，补肾强督方能够抑制BMSCs成骨分化中Wnt通路的激活，上调SOST、GSK3β水平，下调Wnt5a水平，这些均提示该方可能通过Wnt通路抑制AS骨化过程中BMSCs的成骨过程起到调节作用，是否通过该通路发挥作用，还需进一步的实验证明。