皇后帝王花种皮特性对种子休眠的影响

山金凤 刘子嘉 曾莹 陈军 吴向崇 祝遵凌

摘  要  以皇后帝王花種子为实验材料，对其进行形态解剖、种皮超微结构观测、种皮透水性与含水量检测，以了解皇后帝王花种皮结构与种子休眠的关系。结果表明：①皇后帝王花种子的种皮分为3层，外种皮的栅栏结构增强了种子的不透性，高度木质化的中种皮使种子坚硬，内种皮较薄却被一层不易透水的蜡质包裹;②酸蚀处理能使皇后帝王花种子种皮表面结构疏松，种皮变薄，种孔露出。但酸蚀4 h种子的中种皮及内种皮已经出现破坏性开裂，严重影响到胚活力;③完整干种子与酸蚀0.5 h种子在前14 h均能快速吸水，吸水50 h后近饱和状态，自此，二者吸水率小范围波动直至完全饱和;④酸蚀处理种子并不能使胚更好的吸水保水。因此，皇后帝王花种皮结构对胚的吸水并未形成阻碍，但不能排除其对胚呼吸的影响及对胚根的伸长和生长产生机械阻力的可能。

关键词  皇后帝王花;种皮结构;透水性;种子休眠中图分类号  S682.39     文献标识码  A

The Seed Coat Structure of Protea magnifica andIts Effects on Seed Dormancy

SHAN Jinfeng^1，2， LIU Zijia⁴， ZENG Ying^1，2， CHEN Jun¹， WU Xiangchong⁴， ZHU Zunling^1，2，3*

1. Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 2. College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 3. College of Arts & Design， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 4. Sanya Daxing New Landscape Ecological Co. Ltd， Sanya， Hainan 572022， China

Abstract  In order to discuss the seed dormancy characteristics ofProtea magnifica， the seed morphology anatomical structure， seed coat ultrastructure and water permeability were observed. The results showed that： ①The seed coat ofP. magnifica consisted of three layers， the fence structure of the external seed coat enhancing the impermeability of the seeds， the highly lignified middle seed coat protecting the seeds， the thin inner seed coat covered with a layer of water-impervious wax. ②The acid etching treatment could make the seed coat loose， the seed coat thin， and the seed hole exposed. However， the middle seed coat and inner seed coat etched had already undergone destructive cracking after the 4-hours treatment， which seriously affected the vitality of the embryos. ③The dry seeds and seeds etched for 0.5 h could absorb water quickly in the first 14 h treatment， and nearly saturated after 50 h treatment. Since then， the two water absorption rates fluctuated in a small range until they were fully saturated. ④The seed treated by acid etching did not allow the embryo to absorb water， therefore， the seed coat structure ofP. magnifica did not hinder the water absorption of the embryo， but it couldnt be ruled out the the effect on embryo respiration and the possibility of mechanical resistance to radicle elongation and growth.

Keywords  Protea magnifica; structure of seed coat; water permeability; seed dormancy

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.010

皇后帝王花（Protea magnifica）为山龙眼科帝王花属（又名帕洛帝属）多年生常绿灌木，其花朵巨大、色彩美丽、花期持久，是国际切花市场广受欢迎的高档木本切花^[1-2]。原产南非开普敦地区^[3]，一些用于切花生产的帝王花品种已从南非扩展到世界其他地区，如澳大利亚、加利福尼亚、新西兰等^[4]，我国云南地区在近些年对山龙眼科多种切花品种进行了引种研究^[5-10]。然而帝王花属植物的引种成本高，国际运输时间久，并且传统方法出苗率极低^[10]，这给该属植物的引种、扩繁和推广带来了许多困难。目前，国内帝王花输出仅依靠我国云南部分地区，短期内仍难以摆脱对国外进口的依赖。

影响种子休眠的因素较为复杂，除去种子的种皮结构外，种胚是否发育完全、是否存在生理后熟，种皮及胚是否含有发芽抑制物^[11]等都是影响种子萌发的原因。本研究通过对皇后帝王花种子的外部形态、种皮超微结构、种皮透水性与含水量等方面探索皇后帝王花种子休眠原因及皇后帝王花种子生理学研究，为今后探讨皇后帝王花种子休眠机理及实生种苗繁殖提供理论依据。

1  材料与方法

1.1 材料

以2017年12月由哥斯达黎加引进的皇后帝王花（Protea magnifica）种子为实验材料，去除瘪粒、腐坏的种粒及杂质，取新鲜饱满的帝王花种子备用。

1.2方法

1.2.1  种子基本形态观测  外部形态：记录皇后帝王花种子的形状、颜色、表面纹理等特征。

种子大小：四分法随机选取供试皇后帝王花种子300粒，用游标卡尺测量种子长度及宽度，以平均值作为种子大小。

千粒质量：四分法随机选取8组各100粒的供试皇后帝王花种子，1/10 000电子分析天平称重，以8组数据的平均值表示皇后帝王花种子的千粒质量。

内部构造：随机选取10粒供试皇后帝王花种子，在清水中浸泡24 h使其膨胀和软化，去掉外部种皮，分离出胚，并将种子纵切以观察内部结构。

1.2.2  种子超微结构观察  取未经处理的皇后帝王花带壳种子、去壳种子（带内种皮的胚、胚）以及酸蚀带壳种子（98%浓硫酸处理0.5、2、3、4 h，流水冲洗24 h后晾干）粘贴在载物台上，经离子溅射仪喷金镀膜后在FEI Quanta200环境扫描电子显微镜下观察种子整体、表面、种孔处及纵断面结构，记录并拍照后用Image J测量种皮厚度。

1.2.3  种皮透水性测定  取50粒未处理的完整干种子，50粒酸蚀种子（98% H₂SO₄处理0.5 h后流水冲洗24 h），设3组重复，对这6组种子称重并记录质量后，将种子分别放入烧杯再加入60 mL蒸馏水，置于25 ℃的人工智能气候箱中进行吸水实验。定期（第1天日间隔2 h，之后日间隔6 h，夜间隔12 h）将种子取出，吸去种子外部水分，用1/10 000电子分析天平称质量并记录，如此反复，直至种子吸水饱和。吸水率=（吸水后质量–吸水前质量）/吸水前质量×100%。

1.2.4  种子各部分含水量测定  在种皮透水性测定结束后，将饱和状态的皇后帝王花种子剥离为种皮和胚两部分，并以未处理的完整干种子为对照，将其种皮与胚分别放入铝盒中，采用恒高温烘干法测定并计算种子各部分含水量，以了解在吸水实验中皇后帝王花种皮和胚的吸水能力以及种皮是否阻碍了胚的吸水。

含水量= （m₂–m₃）/（m₂–m₁）×100%

式中，m₁为铝盒质量（g）;m₂为铝盒及样品的烘前质量（g）;m₃为铝盒及样品的烘后质量（g）。

1.3数据处理

所得数据采用Excel 2010软件处理，用SPSS 24.0软件分析差异显著性，用Origin 2017软件作图。

2  结果与分析

2.1皇后帝王花种子基本形态

皇后帝王花种子为瘦果，种子长（1.29±0.11） cm，宽（0.75±0.08） cm，千粒質量（199.36±0.23） g。整体轮廓呈卵圆形近圆形，种壳木质，较硬，呈褐黄色或淡黄色，表面具隆起的纵条纹和明显的棱，种脊明显。外种皮有局部开裂脱落（图1A），基部微尖且周围密生棕黄色短绒毛（图1B），内有种孔。种仁近圆形（图1C），内种皮薄且与胚紧密贴合，去除内种皮后的胚呈乳白色（图1D），两片子叶饱满。

2.2皇后帝王花种皮超微结构

电镜观察未经处理的皇后帝王花种子表面，其种皮纹饰清晰，外种皮局部纵裂且有细小裂痕（图2A1），放大200倍，种子表面角质化，凹凸不平（图2A2）;观察种子纵断面（图2A3），其种皮分为3层，外种皮厚度约为269.42 μm，中种皮厚度约为584.34 μm，内种皮厚度约为81.92 μm，外种皮与中种皮贴合紧密，中种皮与内种皮易剥离。外种皮由角质化的表皮细胞，细胞壁强烈增厚的单层栅栏细胞连接而成，其中栅栏细胞厚度约为46.23 μm（图2F1），其结构致密，存在阻碍气体和水分自由扩散的可能;中种皮约占种皮厚度的3/5，细胞高度木质化且排列紧密，靠近内种皮处由多层薄壁细胞排列而成（图2F2）;内种皮较薄，由难透水的蜡质形成一层保护膜（图2F3）;种子顶部残存的扁平花柱处细胞呈长椭圆状，大小不一（图2F4）。

浓硫酸处理0.5 h后，种子角质层受损，表面出现许多微孔（图2B1，图2B2），外种皮已被腐蚀，此时中种皮厚度约为487.731 μm，与酸蚀前种子相比种皮明显变薄（图2B3），并且，种孔周围绒毛和种皮被浓硫酸腐蚀（图2B4）;浓硫酸处理2 h后，种子表面的小孔相互连接形成不同大小的腐蚀坑，坑内有针眼状小孔出现（图2C1，图2C2），中种皮更薄（图2C3），种孔处种皮结构疏松，出现平行于种皮的裂痕（图2C4）;浓硫酸处理3 h后，种子表面布满腐蚀坑（图2D1），部分腐蚀坑形成更深的洞（图2D2），这些坑洞的产生可以很好地增强种子的透性，中种皮进一步变薄（图2D3），种孔处支离破碎，种皮比种子其他部位更薄（图2D4）;浓硫酸处理4 h后，種子一侧的内种皮部分外露（图2E1），种皮表面的裂痕加深，结构更加疏松（图2E2），中种皮厚度约430.66 μm（图2E3），种孔附近部分种皮已被腐蚀，浓硫酸进入内部，伤及胚（图2E4）。

由此可见，酸蚀处理可以有效地破坏皇后帝王花种子坚硬的种皮结构，减小种皮的机械障碍，改善种皮的透水透气性，但很容易酸蚀过头而伤及胚。所以在对皇后帝王花种子酸蚀处理时，需注意根据种子种皮厚度、坚硬度以及干燥程度确定最佳酸蚀时间，使种皮变薄种孔明显而不至于伤及胚。

A1、A2：未处理种子种皮表面结构（50×，200×）;A3：未处理种子种皮纵断面结构（80×）;A4：未处理种子种孔部位（40×）。B1、B2：酸蚀0.5 h种子种皮表面结构（50×，200×）;B3：酸蚀0.5 h种子种皮纵断面结构（80×）;B4：酸蚀0.5 h种子种孔部位（40×）。C1、C2：酸蚀2 h种子种皮表面结构（50×，200×）;C3：酸蚀2 h种子种皮纵断面结构（80×）;C4：酸蚀2 h种子种孔部位（40×）。D1、D2：酸蚀3 h种子种皮表面结构（50×，200×）;D3：酸蚀3 h种子种皮纵断面结构（80×）;D4：酸蚀3 h种子种孔部位（40×）。E1、E2：酸蚀4 h种子种皮表面结构（50×，200×）;E3：酸蚀4 h种子种皮纵断面结构（80×）;E4：酸蚀4 h种子种孔部位（40×）。F1、F2、F3、F4：未处理种子外种皮纵断面结构（300×），中种皮纵断面结构（600×），内种皮纵断面结构（1200×），种子顶端纵断面结构（160×）。

A1， A2： Seed coat structure of untreated seeds （50×， 200×）; A3： Longitudinal profile of untreated seeds （80×）; A4： Seed hole of untreated seeds （40×）. B1， B2： Seed coat structure of acid-etched 0.5 hours seeds （50×， 200×）; B3： Longitudinal profile of acid-etched 0.5 hours seeds （80×）; B4： Seed hole of acid-etched 0.5 hours seeds （40×）. C1， C2： Seed coat structure of acid-etched 2 hours seeds （50×， 200×）; C3： Longitudinal profile of acid-etched 2 hours seeds （80×）; C4： Seed hole of acid-etched 2 hours seeds （40×）. D1， D2： Seed coat structure of acid-etched 3 hours seeds （50×， 200×）; D3： Longitudinal profile of acid-etched 3 hours seeds （80×）; D4： Seed hole of acid-etched 3 hours seeds （40×）. E1， E2： Seed coat structure of acid-etched 4 hours seeds （50×， 200×）; E3： Longitudinal profile of acid-etched 4 hours seeds （80×）; E4： Seed hole of acid-etched 4 hours seeds （40×）. F1， F2， F3， F4： Longitudinal structure of the outer seed coat of untreated seeds （300×）， longitudinal structure of the medium seed coat （600×）， longitudinal structure of the inner seed coat （1200×）， longitudinal structure of the seed top （160×）.

2.3皇后帝王花种子的透水性

由图3可看出，皇后帝王花种子的吸水过程可大致分为3个时期，即快速吸水期（0～14 h）、缓慢吸水期（15～50 h）、近饱和期（51～92 h）。种子浸泡2 h后，二者吸水率迅速增长，完整干种子吸水率为21.13%，酸蚀0.5 h种子吸水率达15.29%。由此可以看出，完整干种子与酸蚀0.5 h种子在快速吸水期间均能迅速吸水。吸水12 h后，完整干种子比酸蚀0.5 h种子的吸水率高6.01%，吸水50 h时，二者吸水率分别达41.03%、34.82%，近饱和期，二者吸水率小范圍波动保持平稳，当吸水92 h后，完整干种子的吸水率比酸蚀0.5 h种子的吸水率高出6.35%。方差分析显示，二者吸水率差异达极显著水平（F=8.05，p=0.008）。

结果表明，皇后帝王花种皮具有一定的透水性，饱和所需的吸水时间较长，这可能是由于木质化的种皮较厚所致。同时，吸水达到饱和时，完整干种子吸水率高于酸蚀种子吸水率的原因很可能是因为完整干种子的种皮完好无损，种子主要靠种孔吸收水分，因此吸水后不易失水。

2.4皇后帝王花种子的含水量

如图4所示，在种子吸水达饱和后，完整干种子的种皮含水量为33.68%，酸蚀0.5 h种子的种皮含水量为30.32%。因此，对皇后帝王花种子进行酸蚀处理，并不能改善种皮透水性，提高种皮含水量。与对照组相比，完整干种子和酸蚀0.5 h种子的胚均能吸收部分水分。在种子吸水饱和后，完整干种子和酸蚀0.5 h种子胚的含水量分别比对照种子的胚高10.80%、9.95%。方差分析表明，完整干种子和酸蚀0.5 h种子胚的含水量无显著

差异（F=1.97，p=0.232），说明对皇后帝王花种子进行酸蚀处理，亦不能增加种胚含水量。由此可见，皇后帝王花种皮对种子吸水的限制并非引起其休眠的主要因素。

3  讨论

皇后帝王花种子的种皮有3层，外种皮表面角质化，内有细胞壁强烈增厚的单层栅栏细胞，其结构致密，存在阻碍气体和水分自由扩散的可能;中种皮最厚，其细胞高度木质化且排列紧密;内种皮较薄，由难透水的蜡质形成一层保护膜。这种厚实而坚硬的种皮结构使皇后帝王花种子在山火频发的原产地得以留存，等待山火过后雨季来临再次重生^[12]。诸多研究表明，浓硫酸处理可有效打破种子的物理休眠^[13-16]。经浓硫酸处理后，皇后帝王花种子表面结构疏松，角质层、栅栏层逐渐被腐蚀，形成大小不同的孔洞，但浓硫酸处理4 h后种子内部受损。因此在对皇后帝王花种子进行酸蚀处理时，时间控制在0.5～2 h，既可减小种皮的机械束缚又不会伤及胚。

在种子透水性实验中，完整干种子和酸蚀0.5 h种子在前14 h均能迅速吸收水分，而后进入缓慢吸水阶段，达到饱和状态的吸水时间较长，这可能是由于外种皮致密的栅栏层及厚实的中种皮的存在。准噶尔山楂^[17]、欧洲冬青^[18]、野生大豆^[19]等种子的种皮中也有类似的栅栏结构延缓了种子吸水速度。含水量测定表明，完整干种子和酸蚀0.5 h种子的胚均能吸收到部分水分。可见，皇后帝王花种皮结构不是引起其休眠的主要原因，但它对种子解除休眠后胚的萌发，特别是胚根突破种皮是否存在阻碍还有待后续研究的探讨。

张俊杰等^[20]对金丝李种子休眠的研究中发现，金丝李果实成熟后，为应对夏季潮湿多雨的环境而逐渐形成特殊种子结构，张海波等^[21]在研究小拟南芥生态适应性中也有相似发现。皇后帝王花在原产地多生长于高山、低山山地及山坡^[22]，那里降水较少，且多集中于冬季，坚硬的种皮使其长期保存生活能力^[23]，这是皇后帝王花在不断适应自然环境变化过程中形成的保存种源的特异遗传性^[24]，本研究通过对皇后帝王花种子种皮结构的观察也证实了这一特性。在自然状态下皇后帝王花种子萌发困难，萌发时间长^[25]，除去它坚韧的种皮透性较差这一原因，其种胚发育、内源抑制物及种子萌发激素等有关内容尚待进一步研究。

参考文献

[1] 陈  静. 饱和D最优设计法在帝王花‘Pink ice扦插中的应用[M]. 北京： 中国林业出版社， 2011： 430-434.

[2] Sauquet H， Cantrill D J. Pollen diversity and evolution in Proteoideae （Proteales： Proteaceae）[J]. Systematic Botany， 2007， 32（2）： 271-316.

[3] Wasson E， Rodd T. 世界园林乔灌木[M]. 北京： 中国林业出版社， 2004： 302-322.

[4] Rodríguez-Pérez J A， Corbella-Tena M. Effect of salinity on seedling emergence of Protea compacta，P. cynaroides， and P. magnifica（Proteaceae）[J]. Journal of Plant Nutrition， 2011， 34（13）： 1930-1939.

• 范贤熙， 胡  秀， 王  奇， 等. 木本切花植物极美泰洛泊的组织培养研究[J]. 西部林业科学， 2006， 35（2）： 86-89
• 王  奇， 胡  秀， 范贤熙， 等. 多花白澳山龙眼组织培养研究[J]. 江西农业大学学报， 2006， 28（5）： 665-668.
• 卢珍红， 段晓梅， 樊国盛. 山龙眼科木本切花市场现状与生产前景分析[J]. 福建林业科技， 2007， 34（2）： 243-246.
• 罗昌国， 樊国盛， 赵晓伟， 等. 不同处理对山龙眼花卉红花卢卡树种子的发芽影响[J]. 种子， 2009， 28（1）： 15-17.
• 罗昌国， 袁启凤， 樊国盛， 等. 3种山龙眼花卉苗木生长特性[J]. 江苏农业科学， 2010（5）： 224-226.
• 曾  力， 樊国盛， 段晓梅. 不同预处理对2种山龙眼科种子出苗率的影响[J]. 福建林业科技， 2009， 36（3）： 141-144.
• 杨期和， 叶万辉， 宋松泉， 等. 植物种子休眠的原因及休眠的多形性[J]. 西北植物学报， 2003， 23（5）： 837-843.
• Brown N A C， Botha P A， Staden J V. Smoke seed germination studies and a guide to seed propagation of plants from the major families of the Cape Floristic Region， South Africa[J]. South African Journal of Botany， 2004， 70（4）： 559-581.

[13] 薛婷婷， 沈永宝， 刘  嘉， 等. 种子物理休眠研究进展[J]. 植物学报， 2016， 51（6）： 863-871.

[14] 王小雪， 孙海菁， 刘  芸， 等. 浓硫酸处理对海滨木槿10个家系種子萌发的影响[J]. 应用生态学报， 2012， 23（11）： 2968-2974.

[15] 贾  娟， 刘  芳， 苏红田， 等. 不同处理方法对5种豆科牧草种子萌发特性的影响[J]. 草地学报， 2012， 20（2）： 342-347.

[16] 侯文焕， 赵艳红， 唐兴富， 等. 不同处理方法对菜用黄麻种子萌发的影响[J]. 热带作物学报， 2018， 39（2）： 231-236.

[17] 张  侠， 李  进， 吕海英， 等. 准噶尔山楂种壳、种皮、种胚特性与种子休眠的关系[J]. 植物生理学报， 2014， 50（6）： 867-874.

[18] 贾有伟， 魏驰宇， 田如男. 欧洲冬青种皮特性与种子休眠的关系[J]. 江苏农业科学， 2017， 45（12）： 96-99.

[19] 徐  亮， 李建东， 殷萍萍， 等. 野生大豆种皮形态结构和萌发特性的研究[J]. 大豆科学， 2009， 28（4）： 641-646.

[20] 张俊杰， 韦  霄， 柴胜丰， 等. 珍稀濒危植物金丝李种子的休眠机理[J]. 生态学杂志， 2018， 37（5）： 1371-1381.

[21] 张海波， 刘  彭， 刘立鸿， 等. 新疆短命植物小拟南芥（Arabidopsis pumila）种子萌发特性及其生态适应性[J]. 生态学报， 2007， 27（10）： 4310-4316.

[22] Schmid B， Nottebrock H， Esler K，et al. Reward quality predicts effects of bird-pollinators on the reproduction of African Protea shrubs[J]. Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics， 2015， 17（3）： 209-217.

[23] 王莹莹， 周  浩， 苏  兵， 等. 攀枝花苏铁种子的种皮结构及木质部管状分子研究[J]. 四川大学学报（自然科学版）， 2011， 48（1）： 247-252.

[24] 潘爱芳. 苏铁种子的种皮结构特征研究[J]. 植物科学学报， 2012， 30（5）： 437-442.

[25] Wu H C， Toit E S D. Effects of temperature， light conditions and gibberellic acid on the in vitro germination ofProtea cynaroidesL. embryos[J]. African Journal of Biotechnology， 2010， 9（9）： 8032-8037.