非洲猪瘟疫苗研发面临的挑战：减毒非洲猪瘟疫苗

陈权

摘 要：本文是《非洲猪瘟疫苗研发面临的挑战》的第二部分，主要介绍非洲猪瘟疫苗的研究情况。

关键词：非洲猪瘟；保护性免疫；非洲猪瘟疫苗；保护性抗原

病毒的毒力依赖于多种关键可变因素，这些可变因素包括：病毒的毒株、病毒入侵的剂量、入侵途径和宿主动物等。疫苗保护/效力研究基本上是对病毒毒力的评估，包括用五种可变因素的免疫接种（使用特定抗原材料/载体、剂量、途径、免疫计划和攻毒时间）对宿主进行预处理。重要的是，保护作用很大程度上受疫苗接种参数和在特定宿主中所有会影响病毒毒力的可变因素的影响。因此，在考虑当前非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）疫苗文献中所述的免疫保护作用时，试验背景尤其重要，因为研究以多种不同的方式进行。研究人员已检测到多种非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）毒株（欧洲毒株、非洲毒株、高毒力、中等毒力、未知毒力、不同程度的组织培养适应性变化、动物通道等）和不同的挑战剂量和途径（高LD50、低LD50、半致死量攻毒、肌肉内攻毒、接触攻毒等）。试验宿主也是可变的，包括不同年龄、品种和条件（常规、无特定病原体动物、近交、年龄和/或体重范围广泛、挑战时持续感染ASFV等）。最后，研究使用了一系列免疫接种方案/时间表，包括免疫接种和免疫接种评估（动物攻毒）之间的可变时期和保护评估的可变标准。鉴于我们对ASFV和ASFV感染生物学的了解有限，很难精确预测这些可变因素的生物学意义及其在ASFV感染和保护性免疫背景下相互作用的可能性。因此，在该特定的研究背景下解释ASF免疫保护结果并推断它们的普遍适用性至关重要。

将减毒ASF病毒（Live-attenuated ASF Virus，LAV）作为疫苗。

1 传统的LAV疫苗

完整的保护性免疫力是在感染ASFV后存活的猪中诱导产生的。猪在感染ASFV中等毒力的毒株或通过传统方法减弱的ASFV毒株后会对同源病毒毒株的挑战产生长期的抵抗力，而对异源毒株的挑战几乎不产生抵抗力。同源病毒毒株交叉保护的范围并不总是清晰的，因为不同的ASFV可能会诱导相同的防护措施，相反，看来好像有密切亲缘关系的ASFV可能无法产生交叉保护。总的来说，由ASFV LAV产生的ASFV免疫保护作用缺乏临床症状和病毒血症减少的特征，病毒血症在发病时要么不出现，要么延期出现，而且滴度明显降低。总之，这些状况可以反映猪体内的病毒复制在早期被控制住了。

2 工程化的LAV疫苗

从理论上讲，我们应该能够设计出安全性高和效力大的减毒ASFV，而不是用传统方式产生的LAV病毒。Tulman和Rock、Dixon等、Chapman等、Tulman等和Corria等在对ASFV进行的比较基因组学和功能性基因组学研究中确定了与病毒毒力和宿主范围相关的ASFV的病毒基因。含有设计缺失特异性毒力/宿主范围基因[包括胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK）基因、9GL（B119L）基因、NL（DP71L）基因和多基因家族360和505（Multigene Families 360 and 505，MGF 360/505）中多个基因成员]的ASFV在宿主体内毒力减弱，且能够诱导动物产生针对同源亲本病毒攻毒的保护性免疫反应。这些ASFV基因推荐的毒力和宿主范围功能很可能成为猪上基因缺失病毒减弱表型的基础。缺失TK基因和9GL基因的ASFV，其毒力的弱化可能是由于这些病毒在猪巨噬细胞（体内ASFV复制的关键靶细胞）中观察到的复制明显缺陷所致。从ASFV欧洲株E70株中缺失NL基因可在不影响病毒体外复制的情况下降低其在猪体内的毒力，且与单纯疱疹病毒ICP34.5蛋白具有共性的NL蛋白被认为可通过指导蛋白磷酸酶1a对真核细胞翻译起始因子（eukaryotic translation Initiation Factor，eIF）-2a脱磷酸化来防止宿主细胞蛋白质切断。通过ASFV MGF 360/505基因抑制宿主体内的I型IFN反应可能是造成一些MGF 360/505基因缺失病毒和猪中其减弱表型观察到的巨噬细胞生长缺陷的原因。

基因缺失对ASFV弱化和免疫原性的影响可能与毒株有关。例如，NL（DP71L）基因的缺失完全减弱了动物中的欧洲E70毒株的毒力，但对两种非洲ASFV毒株的毒力没有影响。此外，ASFV的马拉维毒株和格鲁吉亚毒株的毒力均因TK基因的缺失被减弱，但只有TK基因缺失的马拉维毒株能够诱导受到ASFV攻毒的动物产生保护性免疫反应。

ASFV的多重弱化突变可能会对病毒的免疫原性产生负面影响。Abrams等证明，当两个与毒力相关的基因[NL（DP71L）和UK（DP96R）]从先前减弱的ASFV分离株OUR T88/3的基因中剔除时，免疫动物产生的保护力从100%降低到66%。同样，从ASFV格鲁吉亚分离株剔除9GL（B119L）基因和MGF 360/505基因簇，均会导致病毒的毒力被高度弱化，使其无法诱导免疫动物产生保护性免疫反应。有趣的是，ASFV格鲁吉亚重组病毒仅缺失9GL基因簇或MGF 360/505基因簇，其在猪体内的毒力会被彻底弱化，并且可以保护它们免受ASFV强毒性毒株格鲁吉亚分离株的感染。

3 ASF LAV的安全性

LAV疫苗的安全性和有效性是有联系的，必须在考虑影响病毒毒力的标准、特定病毒分离株、病毒的接种剂量、病毒接种途径和所接种动物的特定背景下进行观察和评估。研究人员已经就试验性ASF LAV提出了重要的安全性问题。

免疫接种后的应答会导致动物发生慢性ASF。在接种ASFV葡萄牙分离株的猪中首次观察到这种情况，該分离株在骨髓细胞培养基中通过连续传代后毒力减弱。同样，在接种了毒力自然弱化的ASFV弱毒分离株ASFV/nh/p68毒株（可能是一个由疫苗衍生的病毒）的动物中，25%～47%的动物出现了慢性病变并暴发疾病，其特征是迟发性发热和病毒血症，以及高水平的ASFV抗体和明显的高γ球蛋白血症。Pan等和Takamatsu等在感染ASFV的其他中等毒力分离株的猪体内同样也观察到了免疫病理学症状——包括高γ球蛋白血症和涉及大量巨噬细胞的全身免疫激活、激活的B细胞和CD8+ T细胞。King等在用潜在的ASF LAV疫苗候选毒株OUR T88/3毒株免疫接种动物后观察到了接种动物出现不太严重的反应，如发烧和关节肿胀等。

研究人员还报告了其他与环境相关的安全问题，包括病毒的毒株和免疫剂量以及宿主的变异性。包括宿主免疫和/或伴随的协同病原体感染状态在内的因素似乎会影响ASFV的毒力。King等和Lacasta等描述了在常规猪中毒力减弱但在无特定病原体猪中仍保持毒力的ASFV毒力弱化的例子。此外，安全的免疫剂量可能是一个问题。对于一些毒力减弱的ASFV，安全剂量和毒性剂量之间的差异似乎很小，并且存在ASFV毒株依赖性。

4 ASF LAV概要

有效性、残留致病性和病毒长期持续存在等问题使人们对目前的试验性LAV疫苗候选株适合在任何情况下的使用提出了重大疑问。然而，在ASFV比较基因组学和功能基因组学上取得的研究进展已经提高了人们对会影响病毒毒力和宿主范围的特殊基因的了解，这些信息已经为理性设计高效的ASF LAV并提高疫苗的安全性做好了准备。目前的挑战仍然是确定减毒突变株的一个特定补体，以便让突变株能够在不同的ASFV基因背景下发挥作用，同时可在不损害保护性病毒免疫原性的情况下最大限度地提高安全性。免疫病理后遗症是LAV疫苗设计时需要考虑的重点。由于我们不了解ASF LAV免疫病理学的机制和病毒宿主之间的相互作用，因此在评估潜在的LAV疫苗候选株安全性时需要非常小心。而且，尽管我们尚不清楚ASFV持续感染和感染后遗症对建立强有力的持久保护性免疫的重要性，但可想而知的是持久性是评估LAV疫苗应考虑的一个因素。具体来说，ASF LAV 提供的保护（在目标细胞 或宿主反应水平上）是否涉及任何由病毒持 续感染引起的干扰机制？□□

原题名：Challenges for African swine fever vaccine development—“perhaps the end of the beginning”（英文）

原作者：D. L. Rock（美国伊利诺伊大学）