重庆潼南朱砂叶螨田间抗性监测及其抗性机制分析

王保军 胡云鹏 申光茂 刘怀

1.5代谢酶基因表达检测

朱砂叶螨RNA提取、基因组DNA去除、反转录等步骤均按照相应试剂盒说明书操作并进行质量检测。采用实时荧光定量PCR方法检测6个P450基因，4个GST基因以及4个CarE基因在田间种群和室内敏感种群之间的表达差异，引物信息见表1。

实时荧光定量PCR采用 SYBR Green法检测，以RSP18为内参基因。反应程序设置为：95℃ 预变性15 s;95℃变性 15 s，60℃退火加延伸30 s，40个循环。实时荧光定量 PCR反应体系为 20 μL，包括：2×SYBR master mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游特异性引物各0.5 μL、无菌去离子水8 μL。所有试验设3个生物学重复，每个生物学重复有2个技术重复。采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量[16]。并用 SPSS 16.0 软件进行显著性分析。

2结果与分析

2.1抗药性测定结果

阿维菌素和丁氟螨酯对朱砂叶螨潼南种群的毒力最高，LC50分别为0.879 mg/L和2.19 mg/L，甲氰菊酯效果最差，LC50为8 014.9 mg/L。与室内敏感种群相比，朱砂叶螨潼南种群对田间施用较多的联苯肼酯和哒螨灵已经产生了明显的抗药性，抗性倍数分别为敏感种群的55.8倍和32.0倍，对阿维菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯表现为低水平抗性。

2.2代谢酶活性检测结果

为明确潼南田间种群对杀螨剂产生抗性的机制，对外源有毒物质代谢的3种重要解毒代谢酶P450、GST、CarE的活性进行了检测，发现田间种群P450、GST的活性均显著高于室内敏感种群，CarE活性虽比敏感种群高，但是未达到显著水平（表3）。该结果表明田间种群对联苯肼酯和哒螨灵抗药性的提高可能是由于其体内P450和GST活性升高所致。

2.3代谢酶基因表达差异分析

2.3.1P450相关基因表达差异

与P450活性相关的基因表达检测结果如图1所示。其中CPR在P450酶系中起着传递电子的作用，是影响整个P450酶系功能的关键因子，通过检测该基因的相对表达量发现，CPR基因在田间种群中的表达量为敏感种群的1.53倍，且差异达到显著水平（P<0.05）。这一结果与P450活性检测结果相符，表明P450活性的改变可能与其对联苯肼酯和哒螨灵产生抗性有关。进一步分析P450基因的表达量也发现田间种群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1三个基因的表达量显著提高，其中CYP392A28的变化最为明显，比敏感种群上调了51.7倍，CYP392A26和CYP384A1则分别上调了2.75和2.41倍。另外两个基因CYP389B1和CYP391A1的相对表达量虽然在田间种群中也有一定程度的提高，但是没有达到显著水平，推测它们在这两种药剂的代谢过程中所起的作用有限。

2.3.2GST相关基因表达量检测

与GST活性相关的基因表达检测结果如图2所示。Mu家族的两个GST基因，GSTM7和GSTM9的相对表达量在田间种群中均显著提高，分别为敏感种群的10.96和4.03倍，且GSTM9具有很高的表达量，表明该基因可能在联苯肼酯和哒螨灵的代谢过程中发挥重要作用。同时，Delta家族的GSTD1基因在田间种群的表达量与敏感种群之间也存在显著性差异，上调了1.59倍，而同家族GSTD2基因的相对表达量反而在田间种群中出现了显著的降低，仅为敏感种群的0.522倍，表明Delta家族的GST在抗性形成的过程中可能存在不同的分工。

2.3.3CarE相关基因表达量检测

与CarE活性相关的基因表达检测结果如图3所示。CarE13和CarE23的相对表达量在田间种群和敏感种群中基本相同，没有显著性差异，与CarE活性检测结果一致。而CarE4和CarE6的相对表达量虽然在田间种群中出现了一定程度的提高，分别为敏感种群的1.80和5.39倍，但由于这两个基因的相对表达量均较低，推测它们对CarE活性的影响有限。

3结论与讨论

本研究通过生物测定明确了朱砂叶螨潼南田间种群对5种常用杀虫杀螨剂的敏感性，从LC50来看，阿维菌素和丁氟螨酯对该螨均有很好的防治效果，并且和室内敏感种群相比，田間种群对这两种药剂还没有产生明显的抗性。阿维菌素虽然已有较长的使用历史，但一直具有出色的杀螨活性，田间抗性监测数据显示朱砂叶螨还未对其产生明显的抗药性[17]。丁氟螨酯是一种新开发的高效杀螨剂，2013年在我国登记上市。虽然在欧洲已监测到田间二斑叶螨逐渐对丁氟螨酯产生抗药性[18]，但国内目前还暂未有田间朱砂叶螨对其产生抗药性的报道。本次抗性检测的结果也表明这两种药剂可以作为优良的替代或轮换药剂用于潼南田间朱砂叶螨的防治。

联苯肼酯和哒螨灵是现阶段田间常用的专性杀螨剂。但生测结果显示潼南田间朱砂叶螨已对这两种杀螨剂产生了中等水平的抗药性，在防控中有必要选用其他作用机制不同的药剂进行轮换替代，以避免当地叶螨种群抗性的进一步发展。此外，虽然田间也时常使用菊酯类药剂防治螨类，然而从甲氰菊酯对朱砂叶螨的LC50来看，效果并不理想。另有研究数据也表明亚致死剂量的菊酯类药剂可能还具有使叶螨生殖力增强的作用，因此不推荐使用菊酯类药剂开展害螨防治[19]。

有害生物可以通过提高体内解毒代谢酶活性来提高其对药剂的代谢速度，这是田间种群对药剂产生低、中抗性的主要原因[2021]。由于抗性监测数据显示朱砂叶螨田间种群对这几种药剂的抗性还未达到高抗水平，因此本研究选择从代谢抗性角度分析可能参与相关药剂代谢的酶和基因。通过检测代谢酶活性发现，朱砂叶螨田间种群体内P450和GST的活性显著高于室内敏感种群，而CarE活性则没有显著性差异，表明P450和GST活性的提高可能与其能够及时代谢联苯肼酯或哒螨灵有关。而相关基因表达差异的结果则显示田间种群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1以及GSTM7和GSTM9等基因的表达量均有显著提高，表明它们是蛋白水平酶活性增强的主要原因。虽然目前关于朱砂叶螨对联苯肼酯和哒螨灵的抗性机制还鲜有报道，但在柑橘全爪螨Panonychus citri的研究中，Ding等[22]发现经哒螨灵胁迫后，柑橘全爪螨体内P450和GST活性会明显提高，并且有多个P450基因对哒螨灵的药剂处理表现出应激性表达现象，而CarE的活性在药剂胁迫前后没有显著性差异。这与本研究的结果一致，证明朱砂叶螨对哒螨灵等专性杀螨剂的代谢抗性极有可能是由于P450和GST基因过表达，进而在蛋白水平引起酶活性的提高，增强了害螨对杀螨剂的代谢能力导致的。

綜上所述，本研究通过抗药性监测，发现潼南朱砂叶螨田间种群对常用的杀螨剂联苯肼酯和哒螨灵均产生了较高的抗药性。甲氰菊酯的杀螨活性不高，阿维菌素和丁氟螨酯则具有较好的杀螨效果，可以作为替代药剂使用。代谢酶活性以及基因表达检测结果表明P450和GST可能协同参与了联苯肼酯和哒螨灵的代谢过程，其中CYP392A28和GSTM9这两个基因的作用可能最明显，而CarE在此过程中所起的作用有限。

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（責任编辑：田喆）