运用DNA条形码技术鉴定茶园蜘蛛物种

邢树文 孙延杰 朱慧 查广才

摘要运用DNA条形码技术， 对广东潮州茶园蜘蛛物种进行了分子鉴定。本研究利用基因测序技术获取了凤凰山区域茶园50种蜘蛛的74条线粒体细胞色素C氧化酶亚基I （mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ， COⅠ） 基因序列。使用邻接法 （neighbor joining， NJ） 构建系统发育树， 运用ABGD（automatic barcode gap discovery）软件对蜘蛛样本进行聚类分析。结果表明： 邻接法构建的系统发育树聚类结果与ABGD软件划分结果以及形态分类鉴定结果相一致， 运用DNA条形码可以有效地对蜘蛛物种进行分子鉴定。这对茶园蜘蛛疑难物种和新物种的鉴定具有重要意义， 在茶园蜘蛛物种多样性的研究中也具有重要价值。由此表明， 基于COⅠ基因的DNA条形码对于本研究中所涉及的蜘蛛物种的划分具有较好的区分结果， 可以作为一种有效的工具在茶园蜘蛛物种鉴定中进行应用。

关键词蜘蛛;分子鉴定;系统发育树;ABGD

中图分类号：Q 959.226.2

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018131

茶园病虫害的生态防控是实现凤凰单丛茶可持续发展的有效途径之一。蜘蛛是农林业害虫重要的捕食性天敌， 是调控虫害的重要生态因子[1]。因此，深入研究保护茶区的蜘蛛物种多样性至关重要。传统的形态学分类已有250多年的历史，全世界蜘蛛已知近47 000种[1]，我国仅记录蜘蛛4 282种[2]，还有大量的物种没有发现。传统蜘蛛分类的方法是依据蜘蛛身体外部形态及其生殖器结构的差异区分物种， 但对于体形、大小、体色相似的蜘蛛物种， 或因区域环境变化引起的种内个体差异， 及处于不同发育阶段的幼蛛， 仅依靠形态特征难免会鉴定错误[3]， 这也是传统分类学鉴定物种受限的原因。自从加拿大科学家Hebert等[4]提出把DNA条形码应用到生物物种鉴定之后， DNA条形码就成为了分类学研究的热点， 尤其在动物物种鉴定上发展迅猛。动物线粒体基因重组率低， 进化速率较快， 且大多数物种COⅠ基因可以使用通用引物进行扩增。 Hebert等利用一段658 bp标准化的COⅠ基因片段对动物进行DNA序列分析，并准确地对动物物种进行了分子鉴定[5]。由此表明， 利用COⅠ基因片段对蜘蛛物种进行分子鉴定具有一定的可行性。国内学者对利用DNA条形码进行物种分类的研究起步较晚，对蜘蛛的分子鉴定研究也较少，如，王丽艳对环京津地区的平腹蛛科[6]、刘娜对我国西南地区狼蛛科和漏斗蛛科[7]、曹潇巍对中国拟遁蛛属[8]及何静超等对河北小五台山蟹蛛科[9]进行了DNA条形码的分类研究。因此，我国蜘蛛分类学家DNA条形码序列基因库的建设和完善还任重道远。蜘蛛分布广， 适应性强， 其形态与体型易受环境变化的影响，因此，传统形态学分类方法对一些隐存种、相近种的雌雄配对， 以及对处于不同发育期的幼蛛的分类鉴定有一定困难， 而运用DNA条形码技术可以解决传统分类上存在的疑难问题。本研究选用分布于凤凰山茶区的50种蜘蛛74个样本作为试验材料， 利用线粒体COⅠ基因片段构建基于分子数据的系统发育树，探索了DNA条形码技术对凤凰山茶区蜘蛛物种鉴定的准确性， 对明确凤凰单丛茶区的蜘蛛资源及蜘蛛物种的多样性具有重要意义。该成果将填补凤凰山茶区蜘蛛分类学及其多样性研究的学科空白， 同时对该茶区生境的保护与评价、蜘蛛资源在生物防治中的应用等具有积极意义。

1材料与方法

1.1标本采集及形态鉴定

本研究所用的蜘蛛样本采集于潮州凤凰山茶区不同海拔高度的茶园，包括凤凰镇桥头村茶园（海拔360 m）、上春村茶园和芼岭村茶园（海拔520 m）、叫水坑村茶园（海拔690 m）和天池茶园（海拔930 m）。本次测序使用了50种蜘蛛的74个样本， 测序前使用形态学分类的方法对蜘蛛样本进行物种鉴定，蜘蛛分类结果如表1所示。

1.2DNA提取与PCR扩增

DNA提取采用Sambrook等[10]和杨聪慧等[11]的方法， 利用Animal tissue Genomic DNA Kit提取蜘蛛总DNA，操作步骤依照试剂盒的操作说明进行。提取的总DNA用琼脂糖电泳检测后置于-80℃冰箱保存、备用。采用Folmer等[12]的方法，使用通用引物LCO1490（5′GGTCAA CAAATCATAAAGATATT GG3′）和HCO 2198（5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）对供试的74个蜘蛛样本进行线粒体COⅠ基因扩增， 扩增片段的长度约为680 bp。PCR扩增体系[13]为25 μL： MasterMix 12.5 μL， LCO1490 （10 μmol/L）＼HCO 2198（10 μmol/L）各0.8 μL， ddH2O 8.9 μL， DNA模板2.0 μL。PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5 min;35个循环，94℃预变性30 s，45℃退火40 s，72℃延伸1 min;-20℃保存。

1.3数据分析

1.3.1DNA序列的比对

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测， 上样量为2 μL， 电压100 V， 在UVP凝胶成像系统下观察和拍照。扩增结果良好（约700 bp有单一的亮带）的PCR产物， 委托苏州金唯智生物科技有限公司进行双向测序。测序结果以Chromas软件判断基因测序峰图质量， 人工校对碱基， 确定COⅠ基因片段序列的正确性，以DNASTAR 6.0软件中的子程序SeqMan拼接双向测序结果， FASTA格式输出，采用Clustal X软件[1314] 对最终校对确认的DNA序列进行多重序列比对分析。

1.3.2系統发育树的构建与遗传距离的计算

利用MEGA 6.0软件， 采用双参数模型（Kimura 2parameter， K2P）[16]计算各分类单元之间的种间遗传距离，同时分析其序列的碱基组成情况及密码子的使用率。画出频率分布直方图， 进行“barcoding gap”[17]分析。以盲蛛序列作为外群， 邻接法（neighbor joining， NJ）构建蜘蛛的系统发育树， 并进行内部分支检验与1 000次bootstrap检验分析， 确定各支系的置信度。如果在进化树上同一个物种能聚成一个单系， 则认为NJ分子系统发育树能将此物种与其他物种区分开， 反之则不能区分开。

1.3.3ABGD的划分

使用ABGD（automatic barcode gap discovery）软件[18]， 基于遗传距离划分样本， 划分在同一组的样本被认定属于同一物种。本试验将50种蜘蛛74个样本的K2P遗传距离矩阵在线提交到ABGD网站（http：∥wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/）， P（prior intraspecific divergence）设为0.001～0.1， 最小相对gap宽度值X（minimum relative gap width）为1.0， 然后将样本划分结果与形态鉴定结果比较对照。

2结果与分析

2.1COⅠ基因碱基组成

利用MEGA 6.0软件[15]对50种蜘蛛COⅠ基因的74条序列和1个外群2条序列进行碱基组成分析， 结果见表2。T、C、A、G的平均含量分别为42.3%、13.1%、26%和18.7%，A+T含量为68.3%，有明显的AT偏向性。蜘蛛COⅠ基因各位点碱基组成频率及替换型式， 如表3所示。平均碱基相同位点为434个， 平均转换数为39个， 平均颠换数为55个， 平均颠换与转换比为0.72; 颠换主要以AT为主， 转换主要以TC为主。

2.2基于P距离的碱基替换饱和性分析

DNA的碱基替换类型有转换（transition， TS）和颠换（transversion， TV）两种类型。本研究对50种蜘蛛74个样本进行DNA 条形码序列扩增分析， 以TS和TV为纵坐标，以遗传距离为横坐标，建立二维坐标图用以估计DNA序列碱基饱和度状况。图1显示，TS、TV随着P距离的增加而线性增加， 未表现出饱和态势， 说明凤凰山区茶园的蜘蛛有很强的系统发育信号， 碱基的位点及置换关系均可用于分析和解释蜘蛛的系统发育， 见图1。

2.3系统发育树聚类结果

本試验中， 对74头蜘蛛样本采用邻接法， 以2条盲蛛目的COⅠ序列为外群构建凤凰山茶区蜘蛛群落的NJ系统发育树， 聚类结果如图2所示。聚类结果表明， 外群两种盲蛛与50种蜘蛛被划分为姐妹群，74个蜘蛛样本聚类后没有出现物种交叉的现象， 50种蜘蛛各自聚成一个单系群， 不同蜘蛛被明显区分。NJ树中显示， 除白触斑蛛Euophrys albopopdis外， 其余不同种蜘蛛的支持率均超过90%以上。

2.4遗传距离与ABGD划分结果分析

以K2P模型计算50种蜘蛛COⅠ序列的种间遗传距离结果表明，522条序列的种间平均距离为0.02～0.229，其中，黑斑盖蛛Neriene nigripectoris与皮氏红螯蛛Chiracanthium pichoni之间的平均遗传距离最大，为0.229，突尾艾蛛Cyclosa conica与浊斑艾蛛Cyclosa confusa、日本艾蛛Cyclosa japonica之间平均遗传距离最小，为0.02。74个蜘蛛样本序列依据 1%的序列差异被分为50组。其中，除白触斑蛛Euophrys albopopdis两个样本不支持该物种外， 其余蜘蛛物种全部一一对应，DNA条形码分子鉴定与形态学鉴定的结果吻合度为98%（49/50）。

本试验对74个蜘蛛样本（包含外群）的ABGD划分结果包括初始划分（initial partition）和递归划分（recursive partition）两种情况。递归划分较为稳定， 遗传距离在0.001～0.1之间， 包括外群在内的74个蜘蛛样本被分成50组， 支持50个蜘蛛物种（见图3）。而初始化分结果在0.001～0.001 7之间， 被分成42.67组，支持42.67个蜘蛛物种; 遗传距离在0.002 8～0.004 6之间， 被划分为48组; 遗传距离在0.007 7～0.100 0之间，被划分为50组。遗传距离在42.67～50.00之间，P值范围浮动较大，不够稳定， 而递归划分较为稳定， 包括外群在内的74个蜘蛛样本被分成50组， 与形态学的鉴定结果吻合度较高（表4）。ABGD的划分结果与NJ树呈现对应关系， 每个 ABGD的划分结果NJ发育树上均已标明， 如图2所示。

3讨论

本研究以邻接法与通用引物对凤凰山茶园的74个不同种类的蜘蛛样本构建NJ系统发育树， 74个样本1%的COⅠ序列利用ABGD分成了50组， DNA条形码技术的分子鉴定结果中， 只有白触斑蛛不支持形态学鉴定结果， 其余蜘蛛物种的分子鉴定与形态学鉴定结果高度吻合。分子阈值分类结果与形态学鉴定的误差只有2.00%， 证明了DNA条形码技术对物种进行分子鉴定的有效性。除白触斑蛛外， 每个蜘蛛物种聚类明显， 没有出现物种交叉现象， 并且均各自聚成一个单系群， 且各单系分支的支持率均超过90%， COⅠ序列在凤凰山茶园蜘蛛的鉴定中准确性较高， 表明本研究的DNA条形码可以作为凤凰山蜘蛛鉴定的重要数据。

ABGD方法是基于一定范围的先验值P自动探测给定数据集的“barcoding gap”[1920]， 在一定程度ABGD减少了阈值定义的人为因素， 降低了基于最小距离法分类法界定的主观性， 并且具有较高的准确性。本研究中运用ABGD软件对凤凰山蜘蛛74个样本进行分组划分， 结果与传统形态学分类鉴定的结果完全一致， 本研究初步评估了凤凰山茶区蜘蛛物种的多样性[21]， DNA条形码技术为该茶区蜘蛛分类学、生态学及相关研究开拓了物种分类新的研究领域和更具备前沿技术的新方法， 为保护和恢复该茶区蜘蛛种群提供了可靠依据[22]。但对一些动物分化期较短的物种， 因其极小的种内遗传距离， 从而导致基于进化树和遗传距离的条形码技术不能准确鉴定这些物种。因此， DNA条形码技术在众多物种鉴定中还需要大量试验的验证， 才能更好地完善其在更多生物物种分类上的应用。自然界中生物因地理区域分布、环境及气温等各种因素的影响，物种分化期和进化速率不同， 只依靠DNA 条形码技术还不能完全区分自然界中千变万化的生物物种。因此， 运用DNA序列的分析对蜘蛛进行分子鉴定必须结合传统的形态分类学方法， 才是快捷、准确鉴定蜘蛛物种的科学方法[23]， 脱离传统分类学而开展DNA条形码研究不可能取得科学准确的成果[2425]。由于蜘蛛存在潜在的新种、隐存种或复合种， 因此， 对蜘蛛物种进行单分子标记是DNA条形码技术应用的关键， 对某一蜘蛛选择特征性的基因片段与其COⅠ序列共同作为DNA条形码的标记基因， 对这些疑难种进行分子鉴定才能获取更高的正确率[26]。在本研究中， 由于受到采集时间、地理区域等因素的限制， 采集的蜘蛛样本数量偏少， 从而凸显所鉴定的蜘蛛物种代表性欠缺。我们在以后的研究中， 将补充各季节和不同海拔、不同环境茶区的蜘蛛标本， 采集更多的茶区蜘蛛DNA条形码序列的数据， 初步构建一个较为完整的凤凰山茶区蜘蛛条形码数据库。

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（责任编辑：田喆）