茉莉酸甲酯调控防御酶活性诱导猕猴桃果实抗采后软腐病

盘柳依 赵显阳 陈明 付永琦

摘要以‘金魁猕猴桃果实为试验材料，研究茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）调控防御酶活性抗猕猴桃采后软腐病的效应。测定了MeJA对猕猴桃软腐病病斑直径、软腐病菌Botryosphaeria dothidea抑菌作用及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶活性的影响。结果表明：在0.001～10 mmol/L浓度范围内，MeJA对猕猴桃软腐病菌B.dothidea的抑制作用隨浓度升高而增强;MeJA对猕猴桃果实最佳诱导浓度和熏蒸时间分别为0.1 mmol/L 和24 h，其诱导效果分别为26.01%和26.85%;猕猴桃果实经0.1 mmol/L MeJA熏蒸处理24 h后，SOD、POD、CAT、APX和PPO活性提高，其中SOD和POD活性分别较对照增加33.85%和61.61%，差异达显著水平（P<0.05）。以上结果暗示MeJA诱导猕猴桃果实抗采后软腐病可能与其提高防御酶活性有关。

关键词茉莉酸甲酯;猕猴桃;软腐病;诱导抗病;防御酶

中图分类号：S 436.634

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018172

猕猴桃果实皮薄汁多、质地柔软，在采收和贮运期间极易腐烂，其中软腐病是导致我国四川、陕西和江西等猕猴桃果实贮藏腐烂的关键原因之一[1]。猕猴桃软腐病主要致病菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和拟茎点霉Phomopsis sp.等，病菌通过果皮或从果面伤口侵入果实，果实发病率高达50%左右，品质严重下降，造成巨大的经济损失[2]。控制猕猴桃果实腐烂的发生是减少其采后流通过程商品价值损失的核心问题[23]。目前猕猴桃果实采后腐烂的控制主要采用化学杀菌剂，但其给食品安全和环境保护带来潜在隐患[4]。利用物理、化学或生物的方法诱导提高果实自身抗病性从而减轻腐烂的发生已成为采后病害控制的研究热点[56]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是从素馨花Jasminum grandiflorum香精油中分离获得的一种植物内源生长调节物质，在植物生长发育和应激反应研究中发挥重要作用[7]。外源MeJA作为重要逆境胁迫信号物质可诱导植物产生系列免疫响应，激发植物抗逆蛋白和防御基因表达。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等防御酶是采后果实重要的活性自由基清除酶;PPO通过催化木质素及醌类物质形成，产生抵御病菌侵入的保护屏障。研究表明，MeJA通过调控SOD、CAT、POD、APX和PPO等防御酶活性，诱导梨[8]、芒果[9]、蓝莓[10]和李[11]等防御蛋白和木质素等抗病物质的合成并活化抗氧化代谢途径，增强果实的抗逆性，从而有效抵御病原菌的侵入，降低果实采后腐烂。在果蔬贮藏过程中，采后果实贮藏品质和抗病能力的评价与防御酶活性密切相关[12]，其相关酶活性高低是果实贮藏质量和品质衰老的重要参考指标[13]。

前人大量研究表明，MeJA在果实采后病害控制研究中发挥积极作用，但少有诱导猕猴桃抗采后软腐病的报道。本课题组在前期预备试验中发现MeJA熏蒸处理可有效诱导猕猴桃果实抗采后软腐病，因此本研究以‘金魁猕猴桃果实为试验材料，筛选MeJA的合适处理浓度和时间，并分析MeJA诱导猕猴桃抗软腐病的效应与防御酶活性的关系，为猕猴桃果实采后软腐病的防治提供理论依据和技术参考。

1材料与方法

1.1供试材料

供试材料为‘金魁猕猴桃Actinidia deliciosa ‘Jinkui果实，采自江西省奉新县农业局猕猴桃试验基地。当果实可溶性固形物含量达到6.5%～7.0%时采收，当日运抵实验室，选择大小均匀、无病虫害、无机械损伤的果实，发汗24 h后待用。

葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea由江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心提供。使用前接种于PDA培养基上于 28℃活化3～5 d，待用。

MeJA购自美国 Sigma 公司，纯度98%，以少量0.1%吐温80溶解，再用蒸馏水配成 10 mmol/L的溶液，备用。

1.2MeJA对B.dothidea的抑菌作用

采用生长速率法。配制MeJA浓度为0、0.001、0.01、0.1、1和10 mmol/L的PDA培养基，在B.dothidea培养平板边缘用直径7 mm打孔器取菌饼，将其分别放置于含不同MeJA浓度的培养基中央，使带菌面与培养基充分接触，28℃恒温培养箱培养，逐日观察记录，待对照组病菌快长满培养皿时用游标卡尺测量病斑直径（约5～7 d）。以蒸馏水PDA培养基为空白对照，同时做以含0.1%吐温80的蒸馏水PDA培养基对照，每个浓度重复3次，按以下公式计算抑制率：

抑菌率=[（空白对照病斑直径-处理病斑直径）/空白对照病斑直径]×100%。

1.3猕猴桃果实接种B.dothidea

猕猴桃果实表面经75%乙醇消毒后用无菌挑针刺破赤道部表皮，将直径7 mm的菌丝块置伤口处，表面覆盖棉球（无菌水湿润）保湿，相对湿度保持在90%～95%，25～28℃恒温培养5 d，测定果实病斑直径。

1.4MeJA诱导猕猴桃果实抗软腐病的效应

1.4.1MeJA诱导猕猴桃果实抗软腐病的浓度筛选

称取适量MeJA于灭菌滤纸片置密闭熏蒸室，使其浓度分别为0、0.001、0.01、0.1和1 mmol/L，20℃下熏蒸处理猕猴桃果实。对照为无菌蒸馏水，每处理15个果实，3次重复。24 h后置超净工作台上通风2 h后接种。各处理接种方法同1.3。根据下列公式计算MeJA对猕猴桃果实软腐病的诱导效果。

诱导效果=（对照组病斑直径-处理组病斑直径）/对照组病斑直径×100%。

1.4.2MeJA诱导猕猴桃果实抗软腐病的持续时间

猕猴桃果实用0.1 mmol/L MeJA于接种前0、12、24、48、72 h熏蒸处理。其他方法同1.3。测定MeJA诱导猕猴桃果实软腐病的抗性持久期。

1.4.3MeJA熏蒸处理与接种顺序对猕猴桃果实抗软腐病的影响

试验分以下4组处理。A组： 猕猴桃果实接种软腐病菌，作为试验对照（CK）;B组：猕猴桃果实先接种软腐病菌，24 h后再用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸;C组：猕猴桃果实用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸同时接种软腐病菌;D组： 猕猴桃果实先用0.1 mmol/L的MeJA熏蒸，24 h后再接种软腐病菌;其余方法同1.3。

1.5防御酶活性测定

参考1.4.1方法，用浓度为0.001、0.01、0.1和1 mmol/L MeJA熏蒸处理猕猴桃果实，24 h后接种B.dothidea，25～28℃恒温培养5 d后取病斑周围10～15 mm的果肉。以含0.1% 吐温80为对照，每处理3次重复，每重复取样15个果实（混合取样法），用液氮将所取样品研磨成粉末，分装成1.0～2.0 g/管后，立即置-80℃保存备用。

SOD活性采用NBT还原法;POD活性采用愈创木酚法;APX活性、PPO活性和CAT活性采用紫外比色法，上述测定指标以每克果实样品（鲜重）每分钟吸光度变化值为酶活性单位（U），具体参考曹建康等[14]的方法。

1.6数据处理与统计分析

采用 Excel 2013和DPS软件对数据进行处理和分析，用单因素方差分析统计各处理平均值的差异，Duncan 氏新复极差法比较各处理间的差异显著性。

2结果与分析

2.1MeJA对B.dothidea的抑制作用

由表1可知，浓度为 0.001～10.0 mmol/L MeJA对B.dothidea均有一定的抑制作用，抑菌效果随浓度的增大而增强。与空白对照相比，0.1%吐温80抑菌率仅为0.23%， 0.001 mmol/L MeJA抑菌率为7.16%，当MeJA浓度增大至10.0 mmol/L时，对B.dothidea的抑菌率达100%。

2.2MeJA对猕猴桃果实抗采后软腐病的诱导效应

MeJA不同处理诱导猕猴桃果实抗采后软腐病的效果见表2。0.001～1.0 mmol/L MeJA熏蒸后，与对照相比，MeJA处理浓度为0.01～1 mmol/L时，其诱导效果先上升后下降。0.001 mmol/L MeJA处理组诱导效果为3.77%，当MeJA浓度为0.1 mmol/L时，诱导效果达最高值26.01%，随后诱导效果逐渐降低。

0.1 mmol/L MeJA于接种前12～72 h处理猕猴桃果实，接种前12 h熏蒸处理病斑直径与对照差异不显著（P<0.05），诱导效果仅为3.70%;接种前24、48、72 h熏蒸组病斑直径显著低于对照，其中以接种前24 h诱导处理最好，其效果达26.85%，与其他处理组差异达显著水平（P<0.05）。

如表2所示，MeJA熏蒸处理与接种顺序对猕猴桃果实抗软腐病影响显著（P<0.05）。MeJA诱导处理后再接种软腐病菌（D组），病斑直径明显小于对照（A）和其他两组，诱导效果达22.00%，而诱导处理与接种病菌（C）同时进行以及先接种病菌后诱导处理（B）的诱导效果仅为8.41%和1.08%。

2.3不同浓度MeJA处理对猕猴桃果实防御酶活性的影响

2.3.1MeJA处理对猕猴桃果实SOD活性的影响

不同浓度的MeJA熏蒸处理后接种，猕猴桃果实SOD活性如图1。在0.001～1.0 mmol/L范围内，除0.001 mmol/L处理外，其他3组浓度处理猕猴桃果实SOD均显著高于对照（P<0.05），其中当MeJA浓度为0.1 mmol/L 时SOD活性达到最高，为对照组的1.34倍（P<0.05）。

2.3.2MeJA处理对猕猴桃果实POD活性的影响

猕猴桃果实经MeJA熏蒸处理后接种，其POD活性如图1所示。0.001和0.01 mmol/L两组低浓度MeJA处理组POD活性与对照组差异不显著（P>0.05），而0.1 mmol/L 处理组显著提高了POD活性，为对照组的1.62倍（P<0.05）。当MeJA浓度增大到1.0 mmol/L时，POD活性则显著下降至对照的67.39%（P<0.05）。

2.3.3MeJA处理对猕猴桃果实CAT活性的影响

不同浓度的MeJA熏蒸处理后接种，对猕猴桃果实CAT活性影响见图1。0.001、0.01和1 mmol/L的MeJA处理降低CAT活性，依次为对照组的96.78%、67.75%和70.97%，而0.1 mmol/L处理组CAT活性则增强至对照的1.23倍，但与对照相比，4组浓度MeJA处理对猕猴桃果实CAT活性影响并不显著（P>0.05）。

2.3.4MeJA处理对猕猴桃果实APX活性的影响

从图1可知，与对照相比，当MeJA浓度为0.001～0.1 mmol/L时，猕猴桃果实APX活性无明显差异（P>0.05）。1 mmol/L的MeJA熏蒸处理后，APX活性显著提高至最高值，为对照组的1.38倍（P<0.05）。

2.3.5MeJA处理對猕猴桃果实PPO活性的影响

猕猴桃果实经不同浓度MeJA处理后，其PPO活性变化如图1所示。在0.001～1.0 mmol/L 范围内，PPO活性先上升后下降，其中0.1 mmol/L处理组PPO活性最高，为对照的1.40倍，其他3组浓度的MeJA处理后，PPO活性均低于对照，在P<0.05水平下，各处理与对照均未达到显著水平。

3讨论

JAs作为植物代谢网络重要信号分子，既可直接抑制病原菌的生长，又能够激发果实的免疫系统，诱导植物防御反应物质的合成，提高果实抵御病原侵染的能力[8，15]。MeJA在转导植物信号过程中，与其他外源诱导物质类似，具有明显的浓度效应[16]。本研究表明，0.001～10.0 mmol/L MeJA对猕猴桃果实采后软腐病菌B.dothidea均有一定抑制作用，且抑菌效果随MeJA浓度升高而增强。当0.001～1.0 mmol/L MeJA接种前24 h熏蒸处理果实，其诱导效应由0.1 mmol/L时最高诱导效果26.01%下降至1.0 mmol/L时9.86%，而前期试验中10 mmol/L MeJA则加重猕猴桃果实软腐病的发生，该结论与MeJA诱导辣椒幼苗抗青枯病[17]和葡萄果实采后病害[18]一致。另有研究表明，MeJA诱导葡萄果实抗采后灰霉病[19]和芒果炭疽病[9]的适宜浓度均为10 μmol/L，而100 μmol/L MeJA处理10 min对苹果果实青霉病的抑制效果最好[7]，但MeJA采前处理诱导梨果实抗黑斑病的最佳浓度为7 mmol/L[8]。此外，MeJA熏蒸处理时间以接种前24 h为宜，而MeJA喷雾处理辣椒幼苗抗青枯病最佳时间为接种前48 h[17];MeJA熏蒸处理与接种顺序对猕猴桃果实抗软腐病影响明显，MeJA先熏蒸处理再接种软腐病菌的诱导效果显著高于先接种病菌再熏蒸处理以及熏蒸与接种同时处理的诱导效果，该结论与郭娟华等[20]应用生防菌控制柑橘青霉病结果类似。以上结果说明MeJA诱导果实抗病效应与其处理方式、果实种类、组织和器官密切相关。

大量研究表明，植物（果实）经MeJA处理后可系统诱导SOD、POD和CAT等防御蛋白的活性水平，而这些酶类物质可清除自由基，或催化抗病物质的合成，减缓采后果实细胞伤害，抵御病原菌侵入[21]。SOD专一清除生物氧化过程中产生的活性氧和自由基，保护植物细胞结构和功能不被破坏;POD既可产生致死入侵病原物的氧化酚等毒性物质又可催化木质素的生物合成，促进受侵组织的木质化作用[22];CAT参与植物抗病等胁迫反应并和其他信号因子存在交互作用[23]。在本试验中采用0.001～1.0 mmol/L的MeJA于接种前24 h熏蒸处理猕猴桃果实后，其SOD、POD、APX、CAT和PPO活性均高于对照，各种酶活性整体呈现先上升后下降趋势，其中SOD和POD活性分别较对照增加33.85%和61.61%。本研究结果与MeJA处理提高蓝莓[10]和双孢蘑菇[24]POD、SOD、CAT、PPO和APX等酶活性结论一致，说明上述5种防御酶与MeJA诱导猕猴桃果实抗采后病害密切相关，其中SOD和POD活性提高最显著，说明这两种酶在MeJA诱导猕猴桃抗软腐病过程可能发挥更重要的作用。另一方面，MeJA诱导果实抗病效应对防御酶活性调控可能受果实、病原菌以及处理方式等多因素影响，各种酶活性变化不尽一致，如本试验发现MeJA可提高猕猴桃果实CAT活性，但另有试验表明MeJA处理抑制了苹果[7]和蓝莓[10]的CAT活性，而收获的豇豆经1 μmol/L的MeJA处理，其CAT、POD和PPO活性均降低[25]。

综上所述，0.001～10.0 mmol/L MeJA均可抑制猕猴桃果实采后软腐病菌B.dothidea的生长，0.1 mmol/L MeJA于接种前24 h熏蒸处理可提高猕猴桃果实POD、SOD、CAT、PPO和APX等防御酶活性，从而降低软腐病的发生。有关MeJA诱导猕猴桃果实抗采后软腐病的分子机理有待进一步研究。

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（責任编辑：田喆）