去卵巢和雌二醇预防性治疗影响大鼠甲状旁腺中PTH基因及其关键调控因子的mRNA表达

李游山 张婷婷 朱瑞 冯自立 白瑜

1. 陕西理工大学维生素D生理与应用研究所，陕西 汉中 723001 2. 陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001 3. 陕西理工大学心理健康教育中心，陕西 汉中 723001

雌激素缺乏通常被认为是导致绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的主要原因。在小鼠模型中，腹腔注射雌激素-RGD肽偶联物，可降低血清钙和碱性磷酸酶的浓度，提高小鼠股骨中钙、磷和矿物质的水平[1]。笔者近期的研究结果表明，对大鼠预防性注射适量的β-雌二醇(β-estradiol，E2)后能够较好的防治去卵巢导致的骨质疏松症，而且不会引起子宫等组织的病变[2]。已有研究[3-5]表明，甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)在机体骨转换中发挥着重要作用，可以显著改善PMOP妇女腰椎、全髋关节、股骨颈的骨密度。PTH的表达和分泌可能受Ca2+浓度、钙敏感受体CaSR(calcium-sensing receptor)、成纤维细胞生长因子FGF-23(fibroblast growth factor-23)、FGF-23受体FGFR1(fibroblast growth factor receptor 1)及其辅助受体Klotho等因素的影响[6-9]。

雌激素和PTH在PMOP发生和发展中可能存在着某种联系，但人们对雌激素和PTH在PMOP发生、发展过程中的作用及调控关系的认识还十分有限，迄今为止尚缺乏雌激素直接调控PTH表达的证据。正常状态下的甲状旁腺细胞中是否存在雌激素受体、雌激素与影响PTH表达的潜在调控因素之间存在怎样的联系，这些问题都亟待解答。

鉴于此，本研究利用去卵巢大鼠骨质疏松模型，分析去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠PTH表达的影响，初步探索甲状旁腺中的ER-α、Ca2+/CaSR以及FGF-23/Klotho受体调控系统中关键基因的表达变化，为女性绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试大鼠和试剂耗材

7周龄SD雌性大鼠(SPF级)购自第四军医大学实验动物中心，实验动物质量合格证号为0032811，许可证号为SCXK-(军)2012-0007。大鼠由人工饲料喂养，饲养条件为：动物房通风良好，12 h光照/12 h黑暗，相对湿度45%～55%，自由进食和饮水。β-雌二醇购自北京索莱宝科技有限公司；TRI Reagent购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO，USA)公司；反转录试剂盒购自Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)公司；SYBR® Select Master Mix购自Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)公司；引物由华大科技(中国深圳)公司合成。

1.2 方法

1.2.1造模、给药及组织样品采集：参照笔者先前报道[2]的方法构建绝经后骨质疏松大鼠模型和实施雌二醇预防性治疗。将18只饲育至3月龄的SD雌性大鼠随机分为以下3组：去卵巢组(ovariectomized，OVX)、β-雌二醇预防性给药组(β-estradiol treated OVX，OVX/E2)、假手术组(sham-operated，Sham)。经背侧部双切口入路切除OVX组和OVX/E2组大鼠的双侧卵巢，摘除Sham组大鼠卵巢周围少许脂肪。术后前3天，每日给大鼠肌肉注射0.2 mL青霉素 G 钠(50 mg/mL)，同时用头孢曲松钠溶液(50 mg/mL)冲洗创面。自术后第10 天开始，按照10 μg(kg·bw)剂量对OVX/E2组大鼠皮下注射β-雌二醇，每日1次。对于OVX和Sham组中的大鼠，则皮下注射等量的溶剂[含有0.01%(v/v)DMSO的生理盐水]。连续给药51 d后，处死大鼠，采集血液、甲状旁腺、股骨和胫骨。将血液样品于室温下斜面静置1 h，然后4 ℃静置过夜，使血清自然析出，于4 ℃、 4 000 r/min, 离心10 min，收集上方血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。将甲状旁腺组织用液氮冷冻处理后，置于-80 ℃冰箱保存备用。首先将不同处理组大鼠的骨组织置于4%的多聚甲醛中，4 ℃固定24 h, 接着依次用25%、50%、75%的乙醇进行梯度脱水，最后置于75%的乙醇中保存。

1.2.2股骨、胫骨的组织形态学观察：首先将固定后的股骨和胫骨转移至10%的EDTA溶液(pH 8.0)中，4 ℃脱钙20 d。接着依次用75%、80%、95%、100%的乙醇进行组织脱水，然后开展二甲苯透明、石蜡包埋、组织切片和H&E染色，最后于光学显微镜下观察股骨和胫骨的形态结构。

1.2.3血清雌激素的测定：参照大鼠雌激素酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司)的使用说明书，准备不同浓度(0、2、4、8、16、32、48 ng/L)的标准样品和5倍稀释后的待测血清样品。取50 μL样品至包被有抗体的96孔板中，37 ℃孵育30 min。空白对照孔中则加入50 μL样品稀释液。然后依次进行洗涤，酶标试剂孵育、洗涤、显色和终止显色反应，最后利用BioTek Epoch全波长酶标仪在450 nm处进行检测，以空白对照调零，计算不同处理组的大鼠血清中的雌激素含量。

1.2.4血清钙含量测定：参照微孔板法钙试剂盒(南京建成生物工程研宄所)的使用说明书，以梯度稀释法配制不同浓度的标准样品。分别取10 μL不同浓度的标准样品和2.5倍稀释后的待测血清样品至96孔板中，以等体积的ddH2O作为空白对照。接着加入250 μL工作液，静置5 min后测定610 nm处各孔的吸光值，进而计算血清钙的含量。

1.2.5实时定量PCR：参照厂家提供的使用说明书，利用TRIzol试剂提取不同处理组的大鼠甲状旁腺的总RNA。对RNA溶液进行吸光度检测和RNA凝胶电泳，以保证总RNA的质量。利用M-MLV反转录酶将0.6 μg RNA反转录成cDNA。基于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用Primer Premier 5.0软件设计大鼠GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， 3-磷酸甘油醛脱氢酶)、PTH、ER-α、CaSR、FGF-23、FGFR1、Klotho和Egr1(early growth response gene 1，早期生长反应基因1)的定量引物(表1)。以大鼠GAPDH基因作为内参基因。以不同处理组的大鼠甲状旁腺cDNA为模板，利用Step One PlusTMPCR仪(Applied Biosystems)进行实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)检测。反应体系为：SYBR Green预混液10 μL，正向引物(4 μmol/L)1 μL，反向引物(4 μmol/L)1 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水7 μL。扩增程序为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。用2-△△Ct法计算靶基因mRNA的相对表达量[10]。

表1 qPCR反应引物Table 1 Primers for qPCR

1.3 统计学分析

利用SPSS 20.0软件的对数据进行单因素组间方差分析，评估各组间的统计学意义。*P<0.05，**P<0.01，nsP>0.05。其中血清雌激素和血清钙测定实验中n=6，qPCR实验中n=3。

2 结果与分析

2.1 去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠股骨和胫骨组织形态的影响

图1 不同处理组大鼠股骨和胫骨的组织形态Fig.1 The histological morphology of femur and tibia in different treated rats注：BM：骨髓腔；TB：骨小梁

探讨雌激素和PTH在绝经后骨质疏松症发生和发展中的内在联系，首先需对供试大鼠进行双侧卵巢摘除手术，并于术后适时进行一定剂量的β-雌二醇预防性治疗。为了分析去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠股骨和胫骨组织形态的影响，笔者利用石蜡切片HE染色法对各处理组大鼠的股骨和胫骨进行组织形态学观察。结果显示(图1)，相比较于Sham组，OVX组大鼠的股骨和胫骨均出现骨小梁断裂、间距变大、结构紊乱等骨质疏松症状，而OVX/E2组大鼠并未出现明显的病理症状。这表明摘除卵巢后引起的卵巢功能缺失可导致大鼠绝经后早期骨质疏松形成，而一定剂量的雌二醇预防性治疗能够较好的预防骨质疏松症的发生。

2.2 去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠PTH的 mRNA水平的影响

为了探讨去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠PTH基因表达的影响，笔者利用qPCR对不同处理组的大鼠甲状旁腺中PTH的mRNA表达量进行分析。如图2所示，摘除卵巢后大鼠PTH的mRNA表达量显著降低，而预防性注射一定剂量的β-雌二醇能够显著提高PTH的mRNA表达量，提示PTH含量不足与绝经后骨质疏松症的发生存在着一定的联系。

图2 不同处理组大鼠甲状旁腺中PTH基因的表达变化(n=3；*P<0.05；**P<0.01)Fig.2 Changes of PTH gene expression in parathyroid gland of rats in different treatment groups(n=3;*P<0.05;**P<0.01)

2.3 不同处理组中大鼠血清雌激素和甲状旁腺中ER-α的表达变化

为了探讨不同处理组间大鼠PTH基因的表达变化是否与血清雌激素含量变化有关，笔者利用ELISA技术分析去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠血清中雌激素含量的影响。如图3A所示，血清雌激素含量在各处理大鼠之间均无显著性差异，在供试时间范围内摘除卵巢并未引起血清雌激素含量的明显降低，雌二醇给药也没有引起血清雌激素水平的显著升高。

为了进一步分析大鼠甲状旁腺中有无雌激素受体ER-α，去卵巢和雌二醇预防性给药能否影响ER-α的表达，笔者利用qPCR技术对ER-α在不同处理大鼠甲状旁腺中表达情况进行分析(图3B)。与Sham组相比，摘除卵巢可在一定程度上提高大鼠甲状旁腺中的ER-α mRNA的表达量，而β-雌二醇预防性给药能够显著降低大鼠甲状旁腺中的ER-α mRNA表达量，提示甲状旁腺中的ER-α可能介导雌激素对PTH基因的表达调控。

图3 不同处理组中大鼠血清雌激素和甲状旁腺中ER-α的表达变化 A：去卵巢和雌二醇预防性治疗大鼠血清雌激素水平的影响(n=6);B：不同处理组大鼠的甲状旁腺中ER-α mRNA表达分析(n=3)；*P< 0.05；**P< 0.01；“ns”表示无统计学意义。Fig.3 Changes of serum estrogen and ER- α expression in parathyroid glands of rats in different treatment groupsA: Effects of ovariectomy and prophylactic estrogen therapy on serum estradiol levels of rats (n=6);B: ER- α mRNA expression in parathyroid gland of rat in different treatment groups (n=3);*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference.

2.4 去卵巢和雌二醇预防性治疗对甲状旁腺中Ca2+/CaSR的影响

已有研究[11-13]表明，甲状旁腺细胞能够通过细胞膜上的CaSR感知胞外Ca2+的微小变化，及时调节PTH的表达和分泌。为了研究去卵巢和雌二醇预防性治疗对甲状旁腺中Ca2+/CaSR调控系统的影响，笔者分析了不同处理组中大鼠的血钙浓度和甲状旁腺中CaSR的mRNA水平。如图4A所示，发现OVX/E2组大鼠的血钙水平显著高于Sham组，但是Sham组与OVX组、OVX组与OVX/E2组之间的差异均无统计学意义。qPCR结果显示，大鼠甲状旁腺中CaSR mRNA的表达量在摘除卵巢后显著降低，而在雌二醇预防性给药后显著上调(图4B)。

图4 不同处理组间大鼠血清钙(A)和甲状旁腺中CaSR表达(B)的变化(n=3;*P<0.05；**P< 0.01;“ns”表示差异无统计学意义)Fig.4 Changes of serum Ca(A) and CaSR expression in parathyroid glands(B) of rats in different treatment groups(n=3;*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference)

2.5 去卵巢和雌二醇预防性治疗对甲状旁腺中FGF-23/Klotho受体调控系统的影响

前人研究[9]表明，Klotho是FGF-23的辅助受体，甲状旁腺中的FGFR1/Klotho受体系统及MAPK途径能够介导FGF-23对PTH基因表达的抑制作用。为了研究去卵巢和雌二醇预防性治疗对大鼠甲状旁腺中FGF-23-Klotho受体调控系统的影响，笔者利用qPCR技术分析该调控系统中的关键因子FGF-23、FGFR1、Klotho和Egr1表达量。结果显示，摘除卵巢能够显著降低甲状旁腺中FGF-23、FGFR1和Klotho的mRNA表达量，而雌二醇预防性治疗可以显著提高FGFR1 的mRNA表达量，却进一步下调FGF-23和Klotho的mRNA表达(图5A～C)。对MAPK途径的标记基因Egr1的进一步分析显示，甲状旁腺中Egr1 mRNA的表达量在不同处理组间存在显著性差异。OVX组Egr1的mRNA表达量显著低于Sham组，却显著高于OVX/E2组(图5D)。上述结果表明，摘除大鼠双侧卵巢可能会降低甲状旁腺中FGF-23-Klotho系统对PTH表达的抑制作用，而雌二醇预防性治疗可进一步降低该受体调控系统的对PTH的调控作用。

图5 不同处理组大鼠的甲状旁腺中FGF-23(A)、FGFR1(B)、Klotho(C)和Egr1(D)的表达分析(n=3;*P<0.05；**P< 0.01;“ns”表示差异无统计学意义)Fig.5 Expression of FGF-23(A), FGFR1(B), Klotho(C) and Egr1(D) in parathyroid glands of rats in different treatment groups(n=3;*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference)

3 讨论

前期研究认为，卵巢功能衰退造成的雌激素分泌不足是引发女性绝经后骨质疏松症的重要原因。因此，通过切除大鼠双侧卵巢来降低血清雌激素水平被视为建立绝经后骨质疏松动物模型的有效途径之一。然而，笔者的研究发现Sham、OVX、OVX/E2组大鼠的血清雌激素含量之间没有显著性差异，摘除卵巢并未引起大鼠血清雌激素水平显著降低，雌二醇预防性治疗也未能显著提高血清雌激素水平，这可能与术后时间较短，肾上腺皮质应激性的合成雌激素有关。沈耿杨等[14]对去卵巢后不同时期的大鼠骨量、骨转换指标、雌激素水平的变化规律进行分析，结果发现在术后12周内大鼠血清中雌激素呈先升高后降低的变化趋势，去卵巢4周后，OVX组股骨骨矿含量和骨密度均较Sham显著降低，但其血清雌激素含量与Sham组之间并无显著性差异，这与此次研究结果基本一致。另有研究[15]表明，低剂量的β-雌二醇给药能够部分抵偿雌激素的应激性合成，且较小剂量的雌激素给药既能产生较强的抵偿效应。此次研究结果表明，雌激素预防性治疗并为引起血清雌激素水平的显著升高，这可能与雌二醇给药的引起的雌激素抵偿效应有关。在供试时间内，相较于Sham组大鼠而言，OVX大鼠的雌激素水平并未显著降低，但其股骨和胫骨组织中均出现典型的骨质疏松症状，提示女性绝经早期出现的骨质疏松症可能并非由雌激素水平分泌不足导致，卵巢摘除引起的卵巢整体功能减退可能是OVX大鼠早期骨质疏松症发生的主要原因，其具体机制仍需进一步探讨。

组织和细胞中是否存在ER决定着其能否响应雌激素作用，雌激素受体ERβ1和ERβ2广泛分布于卵巢、子宫、空肠、甲状腺、肾皮质、骨髓间质和梁小骨等组织器官中[16]。研究[17-18]表明，雌激素能够通过骨中的雌激素受体(ER)来阻断 PKA途径，进而抑制 PTH诱导的破骨细胞的形成。有研究[19]证实雌激素受体ERβ1和ERβ2广泛表达于甲状旁腺肿瘤中，ERβ1激活可引发甲状旁腺相关基因CaSR、VDR、JUN、CALR和ORAI2等基因的转录水平变化，提示甲状旁腺功能的实现与雌激素信号传导密切相关。迄今为止，正常大鼠甲状旁腺中是否存在雌激素受体尚不完全清楚。笔者的研究发现，大鼠甲状旁腺中存在ER-α，去卵巢和雌二醇预防性治疗可改变大鼠甲状旁腺中ER-α基因的表达量，调节局部雌激素信号转导，进而影响PTH的表达和分泌。

CaSR属于G蛋白偶联受体第三超家族，其在机体Ca2+稳态中起重要的作用。研究[11-12]发现，甲状旁腺细胞能够通过细胞膜上的CaSR能够使感知胞外Ca2+的信号变化，及时调节PTH的表达和分泌。细胞外Ca2+水平降低会导致甲状旁腺中CaSR的活化减少和PTH的释放增加，反之则会增加CaSR的活化，抑制PTH的表达[6]。笔者的研究发现，尽管OVX组大鼠股骨和胫骨发生了骨质疏松，但OVX组大鼠血清Ca2+水平相较于Sham组略有升高，两组之间差异并无统计学意义，这与谢肇等[20]的研究结果是一致的。有研究[14, 20-21]显示，摘除卵巢后大鼠骨量先快速降低，然后缓慢回升，而血清钙浓度表现为先升后降的变化趋势。卵巢摘除导致甲状旁腺中PTH和CaSR的表达量降低，预防性注射β-雌二醇则引起PTH和CaSR表达量升高，提示CaSR受体可能参与调节PTH的表达，但具体机制尚不明确。

在正常机体中，FGF-23是通过其受体FGFR1/Klotho降低PTH的表达，增加CaSR和VDR的表达量[22]。有研究[23]报道，慢性肾病患者血液中FGF-23水平的增加，并不能降低PTH的表达量，原因是FGFR1/Klotho受体复合物下调，引起甲状旁腺细胞对FGF-23的抵抗。本次研究发现去卵巢后 FGF-23、FGFR1、Klotho及MAPK途径的标志物Egr1表达量显著下调，雌二醇预防性治疗后FGF-23、Klotho和Egr1的表达量进一步降低，说明去卵巢后的FGF-23/Klotho受体调控系统抑制PTH表达的能力降低，并且短期内预防性注射β-雌二醇后其抑制PTH表达的能力继续降低。

本次研究发现去卵巢和雌二醇预防性治疗会影响PTH基因的表达，雌激素受体ER-α、Ca2+/CaSR调控系统以及FGF-23-Klotho受体调控系统均可能参与PTH的基因表达调控。需要指出的是，机体PTH的表达调控是一个复杂的过程，不排除去卵巢和雌二醇预防性治疗通过改变其他调节因子的水平而影响PTH的表达分泌。该研究不仅有助于阐明雌激素和PTH在绝经后骨质疏松症发生和发展中的调控关系，而且对女性绝经后骨质疏松症的预防和治疗也具有一定的指导意义。