贝类生物活性肽的研究进展

胡 昂，段 蕊，刘志东，张俊杰，蒋 玫，李 磊，孙 鹏，唐保军，马丽艳

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090; 2. 淮海工学院海洋生命与水产学院,江苏连云港 222005)

贝类是中国近海养殖的主要种类，例如牡蛎、扇贝、贻贝、缢蛏等，目前，中国养殖贝类年产量已连续多年位居世界首位[1]。目前，贝类的主要食用部位为贝柱等，而其他诸如贝壳、外套膜、消化腺等加工副产物因成分复杂、加工利用率低等原因在加工时多被抛弃[1-2]。研究表明，贝类含有丰富的蛋白质组分，是生物活性肽研究与开发的良好基质，贝类生物活性肽具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、降血压等功效[3]，因此具有良好的开发利用潜力。通过综述贝类生物活性肽的制备方法、步骤及分离纯化方法、结构特征、生物活性及应用研究进展，期望能够为贝类生物活性肽的研究和利用提供参考。

1 贝类生物活性肽的制备方法

目前，贝类生物活性肽[4-11]的常用制备方法主要包括：酶解法、微生物发酵法等。

1.1 酶解法

酶解法是通过外源酶或者内源酶途径制备贝类生物活性肽的一种方法。酶解法制备的贝类生物活性肽具有生物活性基团暴露较充分、反应条件较温和、反应过程易控制、目标产物靶向性较强、反应重现性较好等优点，已经成为贝类活性肽制备的主要方法之一。酶解法的不足之处在于特定目标产物的分离纯化较困难，该法适用于特定分子量范围目标产物的制备。酶解法制备贝类活性肽采用的蛋白酶主要有：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。相关研究根据温度、pH、酶用量、底物含量和时间等因素开展单因素实验，在单因素实验基础上开展优化实验并进行验证(见表1)[12-34]。

表1 酶解法制备的贝类生物活性肽Tab.1 Bioactive peptide from shellfish by enzymatic hydrolysis

1.2 微生物发酵法

微生物发酵法主要是通过微生物在其生长繁殖过程中产生的高活性蛋白酶来降解贝类蛋白，从而制备生物活性肽的一种方法，因其具有反应条件温和、工艺简单、成本低廉等特点而得到广泛应用。微生物发酵法的不足是目标产物得率较低，分离纯化较困难。该法适用于复杂底物制备生物活性肽。陈应运等[35]利用纳豆芽孢杆菌发酵制备蛤蜊血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽，以体外ACE抑制率及肽含量为评价指标筛选目标菌株。刘姝等[36]以牡蛎肉为原料，利用米曲霉产生的蛋白酶和淀粉酶制备牡蛎水解液，通过单因素试验、正交试验研究发酵条件对太平洋牡蛎蛋白质回收率和糖原回收率的影响。

2 贝类活性肽的分离纯化

2.1 贝类活性肽的分离纯化方法

由于贝类生物活性肽的含量通常较低，因此，其分离纯化程度是贝类活性肽研究的关键环节。贝类生物活性肽分离纯化的主要基本步骤包括：超滤、浓缩、凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。本文重点介绍贝类生物活性肽的超滤和色谱分离方法。

2.1.1 超滤

根据物质的分子量大小，膜分离技术可以分为：微滤、超滤、纳滤和反渗透等。由于膜分离技术操作条件温和，批处理量大且兼具分离、浓缩、纯化和精制等多种功能，过滤过程简单、易于控制等特征，已被广泛应用于生物活性肽的分离纯化。其中，超滤技术因实验条件温和，不需要加热，不会引起温度、pH的变化及造成生物活性物质的变性、失活等特征，已成为一种重要的分离纯化技术[37]。付金霞[38]采用马尿酸法测定杂色蛤酶解产物对ACE活性的抑制作用，结果表明，分子量小于6 KD部分酶解液的ACE抑制率为52.3 %，IC50为1.738 mg·mL-1。张艳萍等[39]采用超滤法对紫贻贝酶解物中的降血压肽进行分离，并比较超滤前后酶解物的ACE抑制活性，结果表明，截留分子量为10 KD的超滤膜能将紫贻贝酶解物的ACE抑制率提高到89.42 %。然而，生物活性肽仅仅利用超滤技术进行分离纯化是远远不够的。经过优化的超滤法能够将蛋白酶解物分离成不同分子量范围的组分，然后，进一步采用色谱法进行纯化得到目标产物。

2.1.2 色谱法

生物活性肽的色谱分离主要采用凝胶过滤法、离子交换色谱法、高效液相色谱等。张莉莉[40]采用葡聚糖凝胶Sephadex G25、Sephadex G15对超滤处理后的扇贝抗氧化活性肽进行分离，收集各组分。张惠婷[21]以DPPH自由基清除率为评价指标，先采用超滤技术对缢蛏多肽进行分级分离，随后采用Sephadex G15凝胶层析法对缢蛏多肽进一步分离，筛选出抗氧化能力最高的分离组分进行后续研究。孙敬敬等[41]以厚壳贻贝为原料制备抗菌肽，利用半制备型反相高效液相色谱分离，接着以分析型反相高效液相色谱进行纯化，研究结果表明，乙腈浓度为25%的洗脱成分具有较强的抗菌活性。色谱法制备获得的生物活性肽纯度较高，经过优化的色谱法可以获得单一生物活性肽组分。

3 贝类活性肽的结构特征

3.1 分子量与贝类活性肽活性的关系

刘姝等[36]利用米曲霉发酵太平洋牡蛎(Crassostreagigas)肌肉蛋白制备抗氧化肽，比较不同截留分子量水解液的抗氧化性、溶解性、乳化性、起泡性，结果表明，水解液分子量为1～3 KD时，牡蛎蛋白水解液抗氧化性最强。闫欲晓等[42]利用Sephadex G50凝胶分离文蛤多肽，结果表明，文蛤水解物中具有抗氧化活性多肽的分子量主要集中于1 KD以下。汪秋宽等[43]利用Sephadex G15葡聚糖凝胶分析牡蛎酶解液，结果表明，分子量为1 191 D和826 D的木瓜蛋白酶酶解物的自由羟基清除率最强，分子量为1 074 D和735 D的中性蛋白酶酶解物的自由羟基清除率最强。综合分析国内外的同类研究发现，生物活性较强的肽通常集中在3 KD以下。进一步分析表明，贝类抗氧化肽主要由5～16个氨基酸组成，分子量约为1～2 KD；降血压肽主要由2～12个氨基酸组成，分子量<6 KD；抗菌肽主要由12～60个氨基酸组成。

3.2 氨基酸序列与贝类活性肽活性的关系

活性肽氨基酸组成、序列的不同对生物活性肽的活性影响差异很大。常见的氨基酸有20多种，由这20多种氨基酸组合而成的蛋白质的生物活性各不相同。ACE抑制肽是由2～12个氨基酸残基组成，氨基酸序列中含有大量的疏水性氨基酸，C端存在Pro、Leu等带正电荷的氨基酸残基通常具有较高的ACE抑制活性；N端存在芳香族氨基酸或碱性氨基酸通常ACE抑制活性较高[44-49]。CHEONG等[50]以太平洋牡蛎为底物选用8种不同商品蛋白酶对其进行酶解，以前列腺肿瘤细胞PC-3衰亡率为指标，纯化获得氨基酸序列为His-Phe-Asn-Ile-Gly-Asn-Arg-Cys-Leu-Cys的多肽具有较强的抗肿瘤活性。CHI等[51]以泥蚶为原料制备泥蚶多肽，利用蛋白/多肽测序仪和ESI-MS分析鉴定抗肿瘤活性肽的氨基酸序列分别为Try-Pro和Glu-Pro。

3.3 立体构象与贝类活性肽活性的关系

生物活性肽的生物活性与其空间结构存在着特定的关系，贝类活性肽的一级结构不同，其形成的空间构象也各不相同。吴体智等[49]采用质谱分析与已有序列比对的方法，确定杂色蛤中ACE抑制肽的氨基酸序列，通过计算机模拟将多肽与ACE蛋白对接，筛选活性多肽，并确定其与ACE蛋白的作用位点。结果表明，ACE的Glu403为一重要的结合位点，且Ala356和Arg522对多肽与ACE的稳定结合也产生了重要的影响。冯晓梅等[52]从牡蛎蛋白的酶解物中分离制备活性多肽并对其结构进行研究，将酶解液分别用Sephadex G25、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和反相高效液相色谱进行分离和纯化得到纯度较高的活性肽，经红外光谱测定表明该肽链是以α-螺旋的构型存在。

4 贝类活性肽的生物活性及其评价

4.1 贝类活性肽的生物活性

根据生物活性对已经报道的贝类生物活性肽进行分类，如表2所示。

大量研究表明，生物活性肽具有功效强、吸收快、可以以完整的形式被吸收，且吸收过程中低耗能或不消耗能量等特性，在功能性食品开发方面具有很好的利用前景，在食品保鲜贮藏及加工方面也具有很高的利用价值[30]。

表2 贝类生物活性肽的生物活性Tab.2 Bioactivity of the bioactive peptides of shellfish

4.2 体外试验评价

体外试验分为化学反应和生物反应2类。化学反应的评价方法因其测量方便而被广泛使用，主要分为基于质子转移的反应与基于电子转移的反应2类。基于质子转移的反应主要包括：氧自由基吸收能力、总自由基捕获抗氧化参数、抗亚油酸氧化等。基于电子转移的反应主要包括：羟自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、还原能力等。田倩等[12]以合浦珠母贝(Pinctadamartensii)贝肉为原料酶解制备抗氧化肽，评价了分离组分在化妆品中的总抗氧化性、DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力。结果表明，将合浦珠母贝抗氧化肽添加到营养霜中能够有效提高营养霜的抗氧化性。李荣乔[16]采用菠萝蛋白酶酶解海湾扇贝制备抗氧化肽，采用DPPH自由基清除能力进行评价。邱春江等[45]采用木瓜蛋白酶水解文蛤蛋白制备小分子肽，采用羟自由基清除能力和超氧离子自由基清除能力进行评鉴。刘媛等[17]以海湾扇贝(Argopectenirradias)和虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)贝肉为原料，研究扇贝品种、蛋白酶种类、加酶量、固液比和酶解温度对水解度及超氧离子自由基清除能力的测定。

细胞培养相对于动物试验和临床试验而言，具有直观便捷的特点，能够方便地得知生物活性肽的生物利用性、代谢规律和生物活性，并且还能确定生物活性肽的毒害作用，进而确定其在人体临床试验中的剂量。

4.3 体内试验评价

体内试验能够较有效、准确地确定生物活性肽的生物利用性和生物功能。体外试验由于无法反映体内实验的相关指标，例如相关物质和酶的活性变化、基因表达的激活或抑制、氧化相关代谢途径等。可消化性、生物利用度和代谢产物等指标用于评价体内试验过程中活性肽的功能特性。林海生[56]以近江牡蛎为原料制备牡蛎肽，采用动物行为学方法考察了牡蛎肽对小鼠空间学习和记忆功能的影响，结果表明，牡蛎肽能够显著提高实验小鼠肝组织和脑组织中超氧化物歧化酶活性，同时降低肝组织、脑组织和血浆中丙二醛的含量，具有良好的体内抗氧化性。WANG等[57]以胃蛋白酶酶解牡蛎蛋白，以20 mg·kg-1的剂量给予患有自发性高血压的大鼠口服，结果表明，牡蛎蛋白的胃蛋白酶酶解物可以表现出较好的抗高血压活性。

5 结语

由于贝类生物资源量大，蛋白质含量较高，因此，贝类生物活性肽的研究也受到广泛关注。尽管关于贝类生物活性肽的研究较多，但多数研究集中于活性肽的制备纯化、生物特性等方面，关于贝类生物活性肽的构效关系和安全性评价等方面研究还不够充分，作用机制的研究更是有限。此外，先前研究获得的有关活性肽结构的阐释仅能作为活性肽作用机理的假设或推测，无法明晰地解释活性肽的作用机制，尤其是关于贝类活性肽的人体试验结果尚缺乏，还需要更多的实验结果去验证和证实。因此，应从多角度、多层次针对贝类活性肽开展深入的研究。现有研究已经证实贝类活性肽的多种生物活性、功能特性。因此，贝类活性肽具有应用于功能性食品、保健品、医药品以及化妆品等领域的潜力。