陈珺, 杨瑾, 刘楠楠, 刘舒媛, 李传印, 张新文, 史荔, 张淑琼**
(1.中国医学科学院&北京协和医学院 医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民医院, 云南 昆明 650041)
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎,主要经血液、性及母婴等途径传播。据世界卫生组织统计,全球每年的HCV感染率约为3%,到2015年感染人数约为7 100万,我国每年HCV感染率约为0.7%,感染人数高达987.5万[1],丙型肝炎已成为严重的社会和公共卫生问题。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)是HCV感染后,机体的免疫系统与病毒相互作用的结果,宿主抗原呈递相关基因在HCV的感染和转归中发挥着重要作用,人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)Ⅱ类分子与HCV感染的相关性已被多项研究证实[2-3],且参与HLA Ⅱ类分子抗原呈递的HLA-DM分子的作用也受到重视。HLA-DM分子可以维持未结合抗原肽的HLA Ⅱ类分子的稳定,并对外源性抗原肽进行加工修饰,促进HLA Ⅱ类分子与抗原肽结合,并延长外源性抗原肽在抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面的暴露时间[4]。HLA-DM基因HLA的Ⅱ类基因区,分为HLA-DMA和HLA-DMB[5]。HLA-DMA和HLA-DMB基因在APC细胞的内质网中合成DMα链和DMβ链,并装配成异二聚体DM分子,然后转移到内体或溶酶体中发挥其功能[6]。HLA-DM基因与经典的HLA Ⅱ类基因类似,也存在多态性。目前HLA国际命名委员会确定的HLA-DMA基因和HLA-DMB基因分别有4个和7个,即DMA *01∶01~01∶04 和 DMB*01∶01~01∶07[7]。HLA-DM基因的多态性影响着DM分子的结构和功能,导致抗原呈递的差异,从而与自身免疫性疾病及感染性疾病的发生相关。已有研究报道,HLA-DM基因多态性与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)[8],类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)[9],Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)[10]等相关,但与感染性疾病的关系研究报道很少。因此本研究拟检测HCV慢性感染人群中HLA-DM基因的多态性位点,并对其进行分型,初步分析HLA-DM基因多态性与云南汉族人群HCV慢性感染的相关性。
根据中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[11]诊治标准及“知情同意”原则,随机抽取在云南省某医院就诊的HCV慢性感染者185名作为病例组。通过临床和实验学检查,患者血清抗-HCV阳性, HCV RNA≥15 000 U/mL持续6个月以上,血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和(或)天冬氨酸转氨酶 (aspartate aminotransferase,AST)升高、肝脏病理学符合慢性肝炎表现,且患者未经抗病毒、保肝等治疗。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎、失代偿性肝病、原发性胆汁性肝硬化、遗传代谢性肝病、肝脏血管病等其他肝病患者。随机抽取同时期正常健康个体180名为对照组,纳入标准为受试者血清抗HCV和HCV-RNA阴性,且血清ALT和AST水平正常。所有受试者均为居住于云南地区的彼此无血缘关系汉族个体,病例组男性91例、女性94例,对照组男性100例、女性80例。采集受试者空腹静脉血5 mL,用EDTA抗凝,按照Qiagen血基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血基因组DNA,于-20 ℃保存备用。
根据IMGT数据库(https://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/allele.cgi)中HLA-DM基因相关序列,选取10个SNP位点作为HLA-DMA和HLA-DMB基因的分型判断标准,所选位点均为HLA国际命名委员会命名HLA-DMA和HLA-DMB基因的特异性位点[7],见表1和表2。分别用引物对HLA-DMA基因的第3外显子,HLA-DMB基因的第2外显子及第3外显子区域进行PCR扩增,扩增引物及扩增长度见表3。PCR体系包括,模板DNA 10 ng,正向和反向引物各10 pmol,TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶,dNTPs),ddH2O 21 μL,反应总体系50 μL。PCR条件为98 ℃预变性5 min,98 ℃变性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 s(共30个循环)。PCR产物进行Sanger测序(测序引物同PCR扩增引物)以检测该区域中的多态性位点。对于有2个以上杂合位点的分型样本,进一步进行TA克隆测序,验证其位点多态性的连锁情况。
采用t检验比较病例组和对照组中的年龄、性别比例、肝功能指标等各项基本信息。使用Pypop[12]软件进行哈迪-温伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium)检验,计算位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD),两位点间的LD关系用D′表示,D′>0.8认为位点间强连锁。统计病例组和对照组法人基因型频率及等位基因频率,构建HLA-DMA-DMB基因单倍型。采用卡方检验(χ2)对HLA-DM基因的基因型频率及单倍型在病例组和对照组之间的分布进行分析。单倍型频率的统计分析结果中,仅列其中频率大于0.02的单倍型,P<0.05认为差异具有统计学意义。对基因型频率的分析结果进行FDR(false discovery rate)校正,调整P<0.05认为差异具有统计学意义。
表1 HLA-DMA 基因第3外显子位点Tab.1 SNPs locus of exon 3 of HLA-DMA
表3 引物序列及片段大小Tab.3 Primer sequences for detecting HLA-DMA, HLA-DMB
病例组和对照组的年龄,性别比较,差异无统计学意义(P>0.05);病例组的ALT和AST水平显著高于对照组(P<0.05),符合HCV慢性感染的诊断标准,见表4。
表4 两组研究对象基本特征Tab.4 Basic characteristics of the subjects
HLA-DMA及HLA-DMB基因的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。HLA-DMA,HLA-DMB各等位基因在病例组和对照组中的分布见表5,经FDR校正后差异无统计学意义(调整P>0.05)。在病例组及对照组中共检出4种HLA-DMA等位基因DMA*01∶01、DMA*01∶02、DMA*01∶03及DMA*01∶04,5种HLA-DMB等位基因DMB*01∶01、DMB*01∶02、DMB*01∶03、DMB*01∶05及DMB*01∶07。分布频率最高的HLA-DMA基因的等位基因为DMA*01∶01,在病例组和对照组中频率分别为0.719和0.672;其次是DMA*01∶02,在病例组和对照组中频率分别为0.249和0.306。分布频率最高的HLA-DMB基因的等位基因为DMB*01∶01,在病例组和对照组中频率分别为0.489和0.544;其次是DMB*01∶03,在病例组和对照组中频率分别为0.311和0.258。
表5 两组HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因频率比较Tab.5 Comparison of allele frequencies of HLA-DMA and HLA-DMB genes in case group and control group
在病例组和对照组中,频率大于0.02的单倍型共有6种,结果见表6。在病例组及对照组中,分布频率最高的HLA-DMA单倍型为DMA*01∶01-DMB*01∶01、在病例组和对照组中的频率分别为0.260和0.322,其次为DMA*01∶01-DMB*01∶03、在病例组和对照组中的频率分别为0.287和0.197。单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率显著高于对照组(0.287vs 0.197,OR=0.134,95%CI为1.529~2.305,P=0.005),单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组(0.024 vs 0.056,OR=0.424,95%CI为0.194~0.944,P=0.031)。
表6 两组HLA-DMA-DMB单倍型频率比较Tab.6 Comparison of haplotype frequencies of HLA-DMA-DMB in case group and control group
病毒的免疫逃逸及宿主的免疫保护力低下是造成HCV慢性感染的两个主要原因,研究表明,HCV慢性感染者的免疫反应能力明显减弱,HCV急性感染后特异性抗体反应明显延迟[13],体内CD4+T细胞和CD8+T细胞反应明显降低[14]。HLA分子可影响抗原肽的呈递,影响宿主的抗病毒免疫应答,从而影响HCV感染的临床结局[2,15]。HLA-DM分子作为HLA-Ⅱ类分子的分子伴侣在抗原呈递的过程中发挥重要作用,当DM分子缺失时,机体不能形成稳定的MHC-Ⅱ类分子-抗原肽复合物[16]。HLA-DM基因多态性导致HLA-DM分子构象和功能的差异,从而影响抗原的呈递效率,因此该基因是疾病易感性研究过程中的重要靶标[4]。Huang等[17]的研究表明,HLA-DMA基因的rs1063478 T在HCV慢性感染组中的频率显著低于健康对照组(0.025 vs 0.177,OR=0.160,95%CI为0.08~0.30,P=0.020),显著降低了HCV感染的风险。进一步研究表明,rs1063478 TT基因型的HCV患者具有较强的病毒持续应答,从而影响聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗HCV的疗效[18]。本研究结果显示,rs1063478(codon140)在HCV慢性感染组中等位基因T的频率为0.257,健康对照组中的频率为0.292,两者的分布差异无统计学意义(P>0.05)。
目前,DM基因多态性与疾病的关联研究集中于自身免疫性疾病的研究。构象分析表明,与DMA*01∶01相比,DMA*01∶03等位基因的氨基酸序列发生了G155A,R184H突变,这两个位点是DM分子与HLA-Ⅱ类分子作用的关键位点,其改变影响了HLA-Ⅱ类分子与抗原肽结合的结合力,有助于延长抗原肽的暴露时间,从而增加了自身免疫性疾病的易感性[19]。因此,无论在RA还是T1D的研究中均表明:DMA*01∶03在RA患者中的频率显著增高 (0.263 vs 0.042,OR=9.00,95%CI为1.10~73.7,P=0.014);在T1D患者中的频率也显著高于对照(0.500 vs 0.080,P<0.05)[1]。此外,在T1D的关联研究中发现,DMA*01∶02的表型频率在德国患者(0.120 vs 0.289,P<0.01)[20]及中国患者中均显著降低(0.108 vs 0.420,P<0.001)[19]。DMA*01∶02与DMA*01∶03与T1D的相关性不同,对其氨基酸序列分析显示,DMA*01∶02的140、155、84位氨基酸分别为I、G、R,而DMA*01∶03为V、A、H,提示其氨基酸序列的改变可能是原因之一。在本研究中,DMA*01∶02在病例组的频率较低(0.249 vs 0.306),但差异无统计学意义(P>0.05),单倍型统计结果显示DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组(0.024 vs 0.056,OR=0.424,95%CI为0.194~0.944,P=0.031),提示DMA*01∶02-DMB*01∶03可能是HCV慢性感染的保护性单倍型。
HLA-DMB基因多态性的研究中,DMB*01∶01的表型频率在T1D患者中显著降低,德国人群[21]中为(0.706 vs 0.978,P<0.05),中国人群[11]中为(0.486 vs 0.736,P<0.05),而DMB*01∶03在患者中显著增高,表型频率分别为(0.284 vs 0.045,P<0.001)和(0.429 vs 0.218,P<0.05)。与DMB*01∶01相比,DMB*01∶03等位基因的氨基酸序列仅发生了I179T突变,而这两个等位基因在T1D中的作用却相反,提示该位点可能是DM分子作用的关键位点。然而,在RA的关联研究中,DMB*01∶03在法国RA患者中的表型频率显著增高(0.183 vs 0.040,P=0.004)[9],但在美国白人RA患者中的研究结果却与之相反,DMB*01∶03表型频率显著降低(0.202 vs 0.445,P<0.05)[21]。本研究中,DMB*01∶03在病例组中的频率较高(0.311 vs 0.258),但差异无统计学意义(P>0.05),而单倍型频率DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率显著高于对照组(0.287 vs 0.197,OR=1.634,95%CI为1.159~2.305,P=0.005),提示DMA*01∶01-DMB*01∶03可能是云南汉族人群HCV慢性感染的易感单倍型。
本研究中,HLA-DMA,DMB分布与Feng等[22]报道的中国汉族群体研究结果一致,DMA*01∶01,DMA*01∶02最为常见,等位基因频率分别为0.694和0.280;同样,DMB*01∶01,DMB*01∶03在中国汉族群体中最为常见,等位基因频率分别为0.525和0.316。然而,HLA-DM基因在中国汉族群体中的分布与美国白人,意大利人存在显著差异,比如 DMB*01∶03位点在中国人群中的等位基因频率为0.316,显著高于美国白人(0.196)及意大利人(0.020)[23-25],提示遗传背景的差异可能导致关联分析的结果不同。且本研究的样本量较少,后续应该扩大样本量对HLA-DM基因与云南汉族人群HCV慢性感染的关系进行进一步的验证。
综上,本研究结果表明,HLA-DMA,DMB等位基因频率在病例组与对照组中的分布无显著差异,但单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率高于对照组,单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组,提示HLA-DM基因单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03,DMA*01∶02-DMB*01∶03可能与云南汉族人群中HCV的慢性感染相关。