大蒜素激活Notch信号靶向诱导sGC转录预防大鼠高血压的机制研究

张 磊 李会芳 伍文彬 刘红梅 杨海艳 王 飞

高血压是一种常见的心脑血管疾病，易导致冠心病、动脉硬化和心肌梗塞等疾病［1］。研究发现，血管内皮功能参与血管张力的调节，与动脉高血压联系紧密，对维持心血管系统的稳态十分重要，内皮功能障碍是导致高血压发生的关键之一［2］。Notch信号通路在心脏及血管的发育和分化中发挥重要作用，Notch受体与配体结合后，释放胞内段受体至细胞核内，并与RBPJ等转录因子和MAML2等激活蛋白结合共激活下游靶基因。sGC能够产生环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），cGMP参与内皮依赖性的NO-cGMP信号通路，并通过调控离子通道、磷酸二酯酶和蛋白激酶等方式调节血管内皮功能和血压［3-4］。此外，大蒜素被证实能够激活胞内Ca2+离子通道从而调节内皮依赖性的血管舒张［5］，其具有强效抗氧化的作用，能够有效保护患者的内皮功能并降低高血压患者的血管收缩压和舒张压［6］，但其具体机制不明。基于以上，本文推测大蒜素保护血管内皮的机制可能与Notch信号调节血管中cGMP的产生有关。具体研究如下:

材料与方法

1.实验材料 60只，体质量为180～220 g的实验大鼠，购自成都中医药大学动物实验中心，其中原发性高血压大鼠（SHR）40只，假手术组（Sham）20只。用于提取动脉血管RNA的纤维类组织RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技公司，反转录cDNA试剂盒购自promega公司，兔抗大鼠Notch3、GUCY1A1、MAML2、FRYL、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR） 和GAPDH抗体购自proteintech公司，RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，ECL显色液购自美国Thermo公司，大蒜素Allicin（15 mg/mL，20130316）购自徐州莱恩药业有限公司、去氧肾上腺素粉剂phenylephrine（500 mg，PHR1017）和乙酰胆碱粉剂Acetylcholine（25 g，A6625）均购自美国sigma公司，双荧光素酶报告系统检测试剂购自Promega公司，转染试剂X-tremegene购自罗氏公司，小干扰RNA si-Notch3由上海吉玛公司合成。

2.实验方法 （1）实验动物分组及处理:根据实验需求将60只实验大鼠分为三组:假手术组（sham），高血压组（SHR）和大蒜素处理高血压大鼠组（SHR+Allicin），每组20只。SHR+Allicin组每天喂食30 mg/kg的大蒜素/水混合液（大蒜素和水体积比1∶9），共喂食14 d，分别在0 d、7d和14 d对三组大鼠进行观察。

（2）大鼠血管收缩压检测:采用ALC-NIBP无创血压测量仪检测三组大鼠尾动脉血管的收缩压，每只大鼠检测三次，检测时间点为给药的第0 d、7d和14 d，取平均值作为最终数据结果。

（3）血管反应性及内皮功能检测:给药14 d后，从sham组、SHR组和SHR+Allicin组大鼠尾动脉剥离具有完整内皮的长约3～4 mm的血管环，经40 mM KCl处理预处理两次后，再采用不同浓度的乙酰胆碱（10-9～10-4M）和去氧肾上腺素（10-9～10-4M）分别评估内皮功能和血管反应性。

（4）细胞培养:人类主动脉血管平滑肌细胞（T/G HA-VSMCs）购自美国ATCC公司，细胞培养采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基（购自Hyclone公司）。转染或大蒜素处理前，保证细胞生长密度达到70%～80%。处理时，每孔加入2 mg的大蒜素或2μg si-Notch3干扰小RNA片段，处理24 h后进行各项试验检测。

（5）实时定量PCR检测:采用纤维类组织RNA提取试剂盒提取各组大鼠尾动脉血管组织及T/G HA-VSMCs细胞的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，荧光定量PCR检测Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、GUCY1A1、GUCY1B1、MAML2、FRYL、VEGF和VEGFR的表达水平。各检测基因的QPCR引物见表1。QPCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 QPCR检测引物

（6）western blot检测:向T/G HA-VSMCs细胞中加入RIPA蛋白裂解液，至4℃离心机以12 000 r/min离心10 min，吸取上清加入4倍体积的SDS loading buffer，混匀后放入100℃水浴5 min。取30 μg的蛋白裂解液加入8%SDS-PAGE凝胶中分别以60 V和100 V电压进行蛋白浓缩和分离，然后转至PVDF膜，以10%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入兔抗大鼠Notch3、GUCY1A1、MAML2、FRYL、VEGF和VEGFR抗体，4℃过夜孵育后，ECL发光液显色。

（7）荧光素酶报告载体的构建及转染:采用MEME在线预测GUCY1A1启动子上游2 000 bp的启动子序列，发现-944 bp处存在RBPJ的结合位点atcacat。从人基因组中钓取GUCY1A1启动子片段，并构建入pGL3-basic载体中。带酶切位点的引物为Kpn I-GUCY1A1-F:GGTACC TTTAGCTGAAACCGTTGA，Nhe I-GUCY1A1-R:GCTAGC GTAGCGTTGTGATGGATC，构建成功后提取质粒，命名为pGL3-Wt。GUCY1A1启动子上RBPJ位点的缺失突变由上海生工公司完成，采用DNA合成技术合成不含有atcacat位点的GUCY1A1启动子，并将此序列克隆至pGL3-basic载体，命名为pGL3-Mut。实验组将pGL3-Wt或pGL3-Mut与pRL-TK载体共转染入T/G HA-VSMCs细胞中，对照组转染pGL3-basic与pRL-TK，每孔转染剂量为2μg。转染24 h后，裂解细胞并采用promega荧光素酶分析仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，两者比值为荧光素酶的相对活性。

（8）染色质免疫共沉淀:取出生长至90%以上的细胞，加入37%多聚甲醛，室温交联10 min后，加入甘氨酸终止交联。将细胞培养基吸出，加入预冷的PBS润洗两次后，将细胞刮下并4℃下以2 000 r/min离2 min，收集细胞沉淀加入SDS Lysis Buffer后进行超声破碎。将超声后的细胞分为3组:input组、IgG阴性对照组和加anti-Notch3抗体组。4℃过夜孵育后，于每组加入ProteinA磁珠，孵育2 h后洗涤沉淀复合物。将洗涤后的DNA片段用于QPCR分析，设计GUCY1A1启动子-944位点的QPCR引 物， 上 游:5'-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3'； 下 游:5'-CCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCTTG-3'。 以input为内参，结果采用2-△△Ct法计算相对值。

3.统计学分析 采用GraphPad Prism 6.05软件统计分析实验数据。计量资料以均数±标准差表示，单因素方差分析One-Way ANOVA和Student's t检验进行差异比较分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.大蒜素降低SHR大鼠的血管收缩压和血管反应性，并增强血管内皮功能 由表2可知，SHR组和SHR+Allicin组大鼠的尾动脉血管收缩压在7 d和14 d明显高于Sham组，SHR+Allicin组的血管收缩压显著低于SHR组，提示大蒜素对SHR大鼠具有降血压的效果。由图1可知，与sham组相比，去氧肾上腺素随浓度增高能够明显增加SHR组大鼠的血管反应性，但SHR+Allicin组大鼠的血管反应性则较SHR组显著降低；乙酰胆碱处理后，相比Sham大鼠，SHR组大鼠的血管内皮功能明显降低，而SHR+Allicin组大鼠血管内皮功能则明显恢复，几乎与Sham一致，提示大蒜素能够降低血管收缩压、血管反应性和增强血管内皮功能。

图1 大鼠主动脉血管反应性及内皮功能检测 注:与Sham组比较，a P＜0.05；与Sham组比较，b P＜0.01；与SHR+Allicin组比较，c P＜0.05；与SHR+Allicin组比较，d P＜0.01

图2 大蒜素激活高血压大鼠主动脉血管的Notch3信号并诱导GUCY1A1的表达 注:**P＜0.01，ns:P＞0.05

表2 大鼠血管不同时间收缩压检测（mmHg，）

表2 大鼠血管不同时间收缩压检测（mmHg，）

注:1 mmHg=0.133 kPa，与Sham组比较，a P＜0.05；与Sham组比较，b P＜0.01；与SHR组比较，c P＜0.05；与SHR组比较，d P＜0.01

组别 个数 0 d 7 d 14 d Sham 20 110.50±5.80 112.10±3.90 113.10±4.20 SHR 20 115.22±4.11 173.29±2.73b 176.21±3.13b SHR+Allicin 20 120.10±7.51 135.40±5.11ac 126.51±4.88ad F值 0.153 10.622 12.112 P值 0.375 0.007 0.002

2.大蒜素激活高血压大鼠尾动脉血管的Notch3信号并诱导GUCY1A1的表达 检测4个Notch信号受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，以及sGC编码基因GUCY1A1和GUCY1B1的mRNA表达水平。结果发现，Notch1-3以及GUCY1A1和GUCY1B1在SHR大鼠中的表达均显著低于sham组（P＜0.01），而仅有Notch3和GUCY1A1的表达水平在SHR+Allicin组中有明显回升（P＜0.01），提示大蒜素能够激活Notch3受体，并诱导GUCY1A1的表达。

为证明大蒜素能够同时诱导Notch3和GUCY1A1的表达，进一步采用相关性分析，发现无论在SHR组 还 是SHR+Allicin组，Notch3和GUCY1A1的表达水平均呈明显正相关（SHR:r=0.507 6，P=0.022 3；SHR+Allicin:r=0.467 2，P=0.037 8）。

图3 大蒜素处理及Notch3的瞬时干扰对Notch通路及血管相关基因的影响 注:**P＜0.01

图4 GUCY1A1启动子转录活性及RBPJ转录结合位点的鉴定 注:**P＜0.01

3.大蒜素处理及Notch3的瞬时干扰对Notch通路及血管相关基因的影响 采用si-Notch3的瞬时干扰、QPCR及western blot技术检测大蒜素处理后的血管平滑肌细胞（T/G HA-VSMCs）中Notch信号相关基因（Notch3、MAML2和FRYL）、sGC编码基因GUCY1A1、以及反应血管内皮功能的因子（VEGF和VEGFR）的表达水平。如图3所示，大蒜素能够显著增加T/G HA-VSMCs中Notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表达，但对MAML2和FRYL的表达无影响，因此证明，大蒜素能够增强notch3信号和促进GUCY1A1的表达，但无法激活notch信号的共激活蛋白MAML2和FRYL的表达。干扰Notch3信号导致大蒜素诱导的Notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表达明显降低，对MAML2和FRYL的表达无影响，提示GUCY1A1、VEGF和VEGFR是Notch3的下游基因，Notch3可能通过靶向诱导GUCY1A1表达从而增强血管内皮功能。

4.GUCY1A1启动子转录活性及RBPJ转录结合位点的鉴定 据文献报道可知，Notch信号进入细胞核后与转录因子RBPJ、共激活蛋白MAML2和FRYL结合共同靶向激活下游基因的表达［7-8］。采用生物信息学方法预测GUCY1A1转录起始位点上游2 000 bp启动子并分析其-944 bp存在潜在的RBPJ结合位点atcacata，进一步采用染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告系统对大蒜素和si-Notch3处理后的T/G HA-VSMCs进行检测，结果发现大蒜素能够增强Notch3复合物与atcacata位点的结合并增强GUCY1A1启动子的活性，干扰Notch3则阻遏了大蒜素对GUCY1A1启动子活性的增强作用；通过缺失突变GUCY1A1启动子上的atcacata位点，发现与未处理组相比（mock），经大蒜素诱导的GUCY1A1启动子活性几乎未发生改变，且干扰Notch3后的GUCY1A1启动子活性亦无明显变化。以上结果证实大蒜素能够促进Notch3与GUCY1A1启动子结合，并增强GUCY1A1启动子的转录活性。

讨 论

内皮对于维持心血管系统的稳态至关重要，血管的内皮依赖性扩张是影响血管内皮功能的主要因素，健康的内皮细胞能够连续释放多种生化物质，以自分泌、旁分泌和全身方式参与平滑肌收缩、血管壁通透性、血小板聚集、凝血、纤溶活性的活化和细胞增殖，此外还能防止炎性细胞粘附血管，而内皮功能受损则会引起以上功能失调，导致心血管疾病的发生［9］。内皮功能障碍对血管反应和血压调节具有重要影响，本研究通过对高血压大鼠口服大蒜素，发现高血压大鼠的血管反应性显著降低，内皮功能则显著提高，证实大蒜素对血管内皮功能的保护作用。通过检测血管收缩压，进一步证实大蒜素对SHR大鼠具有降血压功能并能够长期维持其降血压的效果。

可溶性鸟苷酸环化酶sGC是一氧化氮NO的唯一受体，sGC与NO结合会催化cGMP才产生，形成NO-sGC-cGMP通路并调节血管重塑和炎症反应，从而参与心血管疾病的发生。sGC由α和β两种亚基构成，编码基因分别是GUCY1A1和GUCY1B1。研究表明GUCY1A1和GUCY1B1主要表达在大多数器官的血管壁中，通过调节GUCY1A1和GUCY1B1的表达可以控制sGC和cGMP的产生，进一步参与高血压的调节［10］。本研究发现高血压大鼠尾动脉血管中的GUCY1A1和GUCY1B1表达显著下调，而大蒜素处理后的高血压大鼠血管中的GUCY1A1表达水平明显升高，GUCY1B1则无显著变化，提示GUCY1A1可能是参与高血压调节的关键基因。一些研究认为Notch信号通路可能是调控高血压疾病发生的关键通路，原因之一在于notch是sGC表达调控因子，chang等亦发现notch的共激活转录因子RBPJ在GUCY1A1和GUCY1B1启动子区域存在潜在的结合位点［11-12］。这些依据提示Notch通路参与高血压的调节，其机制可能是通过调控sGC的表达。在Notch的4个受体中，Notch3主要在远端动脉的血管平滑肌细胞中表达，主要参与动脉血管的分化和成熟［13］，Notch3功能缺失则会促进血管紧张素II诱导的高血压发生［14］。本研究发现高血压大鼠的notch1-notch4的表达水平均明显低于sham组，而经大蒜素处理的高血压大鼠中仅notch3的表达明显回升，进一步采用相关性分析，发现notch3和GUCY1A1在SHR组和SHR+Allicin组大鼠中的表达呈显著正相关，提示notch3是参与高血压调节的主要受体。

为证实notch3参与大蒜素对大鼠高血压的调节机制，本研究采用大蒜素和Notch3干扰小RNA片段处理血管平滑肌细胞（T/G HA-VSMCs），发现大蒜素能够诱导notch3、GUCY1A1、VEGF和VEGFR的表达，si-Notch阻遏了大蒜素的诱导效果，但参与notch信号转录调控的MAML2和FRYL的表达水平无明显变化，提示大蒜素可能通过诱导notch3受体表达从而保护血管内皮功能，而不是通过诱导notch信号的共激活蛋白MAML2和FRYL。采用生物信息学分析GUCY1A1启动子，发现其上游-944 bp处存在RBPJ的潜在结合位点atcacata。经染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告系统方法证实大蒜素能够增强Notch3转录复合物和GUCY1A1启动子的结合，并提高其转录活性，而si-Notch3则阻遏了两者的结合能力和GUCY1A1启动子活性。

综上所述，本研究发现大蒜素能够保护SHR大鼠的血管内皮功能并降低其血管收缩压和血管反应性，其主要机制可能是通过激活Notch3信号形成转录复合物，并通过转录激活GUCY1A1诱导sGC的产生，这为大蒜素用于高血压的防治提供新的理论依据。