低氧诱导因子-1α减轻七氟烷处理小鼠心肌缺血再灌注损伤中的研究

徐聪杰 景晓刚

心肌缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）在心血管疾病中是一种常见的损伤和危险，在发生缺血心肌再灌注时，心肌细胞以及内皮细胞受到损伤应激而释放IL-1β，IL-6，TNF-α等炎性因子［1-3］，诱发心脏部位局部的炎症性反应，最终导致心肌纤维化，心肌细胞凋亡，心功能受损以及心肌梗死面积扩大化等不良影响。而在长时间心肌缺血到来之前的短暂缺血可以对心肌有一定的保护作用，长期缺血则引发炎症反应［4-6］。缺血/再灌注时期，受损的心肌细胞可释放DAMPs蛋白由Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）蛋白识别，TLR4被激活参与多条通路反应后进一步使NF-κB被激活进一步促进炎性因子的表达释放，从而诱发炎性反应，有可能使心肌细胞走向凋亡［7-9］。

缺血/再灌注时心肌细胞中会出现线粒体形态和结构的动力学改变，打破了线粒体融合裂解的动态平衡，最终易引发凋亡。七氟烷在临床上广泛应用于挥发性吸入麻药，有研究发现，七氟烷的后处理可增强线粒体外膜上的Mfnl蛋白表达，使心肌受到保护［10］。

低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是一种在细胞核内表达的转录因子HIF-1的亚基α亚基，其作用在于作为氧调节单位来决定HIF-1的生物学活性［11-13］。当环境中氧浓度在5%以上时，HIF-1α在雌三醇泛素连接酶的作用下被降解，因而在高氧浓度中很难检测到HIF-1α。近年来有研究发现，在动物I/R中，HIF-1α的表达上调能保护到I/R心肌细胞，因其在生理和病理条件下可参与调控多种基因表达，使机体对低氧环境应激而逐渐适应。有研究证明，HIF-1α可降低心肌酶活，抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死的面积。本次研究，我们拟采取心肌损伤/再灌注并用七氟烷后处理的小鼠作为研究模型来探究HIF-1α在此过程中的作用，从而为临床缺血性心脏病的治疗提供理论和实践依据，现将结果报告如下:

材料与方法

1.实验动物分组与处理 选取健康，雄性，小鼠，8周龄，50只，随机分为五组每组10只分笼饲养，保持饲养环境清洁，室温在25℃左右，湿度在60%左右，使小鼠适应一周。五组小鼠分别进行如下处理:（1）对照组:对小鼠的心脏冠状动脉左前降支进行穿线处理但不结扎，即刻吸入浓度为1.0 MAC（约1.7%）七氟烷3 min。 （2）I/R组:将小鼠心肌缺血处理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化钠溶液进行干预，即刻吸入浓度为1.0 MAC（约1.7%）七氟烷3 min。 （3）DMOG+I/R组（HIF-1α稳定剂联合心肌缺血/再灌注）:将小鼠心肌缺血处理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化钠溶液进行干预，即刻吸入浓度为1.0 MAC（约1.7%）七氟烷3 min，术前24 h进行40 mg/kg的DMOG腹腔注射。（4）YC-1+I/R组（HIF-1α抑制剂联合心肌缺血/再灌注）:将小鼠心肌缺血处理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化钠溶液进行干预，即刻吸入浓度为1.0 MAC（约1.7%）七氟烷3 min，术前30 min进行2 mg/kg的YC-1股静脉注射。

2.仪器与试剂 （1）主要仪器:HX-300动物呼吸机，荧光定量PCR仪，电泳仪，湿转膜仪，冷冻离心机，多功能酶标仪。

（2）主要试剂:3% Evans blue，TTC，DMOG，YC-1，GAPDH一 抗，HIF-1α一 抗，NF-κB一 抗，TLR4一抗，SOD一抗，BCL-2一抗，Bax一抗，ECL发光试剂盒，real-time PCR试剂盒，dNTP，RNA提取试剂盒，MPO试剂盒。

3.实验方法:（1）I/R模型制备:将小鼠术前禁食12 h，腹腔注射0.1 mL 10%水合氯醛/100 g体质量，待小鼠麻醉后使其仰卧固定，连接好心电监测电极，于颈部正中行2 cm左右切口，分离肌肉制作气管插管，连接呼吸机辅助呼吸，参数设定为潮气量2～3 mL，吸入氧浓度为50%，呼吸频率为60～0次/min。同时记录好标准Ⅱ导联心电图。于小鼠胸骨正中左侧部位纵向切口，约2 cm，分离皮下组织与肌肉，剪断第3，4肋骨，借助扩胸器撑开胸部，将冠状动脉左前降支结扎，再将线两端穿入PE管，再用持针器夹PE管前推使心脏缺血。心电图若显示ST段有抬高则为造模成功。缺血45 min之后可打开结扎线，关闭胸腔使再灌注，持续3 h后处死小鼠。取出心脏左心室前壁组织待用。

（2）七氟烷后处理:在小鼠恢复供血的开始立即使其吸入1.0 MAC的七氟烷约3 min。

（3）测定心肌梗死面积:采取TTC/Evans blue双染法，将小鼠开胸后钳夹左前降支，向颈静脉注入2～3 mL的3%Evans blue，则缺血的心肌不变色，未缺血心肌为蓝色。之后经耳缘静脉注入10%氯化钾（2 mL/kg），心脏停跳可开胸取出心脏，用0.9%氯化钠液冲洗并剥离心包，用保鲜膜包裹离体心脏后于-20℃保存1 h，由非梗死区纵切左心室，然后将通过在平行于房室沟的方向将缺血区切成厚度为1～2 mm的4片，再用1%的TTC浸没，37℃避光水浴10～15 min。之后用10%的甲醛固定10 min。

若心肌组织正常则可被染为蓝色，若发生缺血但未发生梗死则为红色，若发生梗死则为白色。将图像拍照后使用Image pro plus 6.0软件分析各区域的面积，计算危险区面积%（即非正常区）（AAR/LV，%）=（危险区总面积/左心室总面积）×100%，以及心梗面积%（An/AAR，%）=（梗死区面积/危险区总面积）×100%。

（4）对小鼠心肌细胞的相关检测:提取小鼠心肌细胞蛋白与RNA，检测其中HIF-1α，NF-κB，TLR4，SOD的mRNA水平以及蛋白表达水平，凋亡相关蛋白Bax，BCL2的表达水平；利用试剂盒检测心肌组织MPO活性等。

1）western blot检测蛋白表达:蛋白提取:取小鼠心脏约50 mg剪碎匀浆后，加入混合有PMSF的RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶1 000）500μL，冰上裂解1 h后置于冷冻离心机中12 000 g离心15 min，取上清混入SDS置于100℃煮沸变性10 min，冰上放置10 min，而后置于-20℃待用。电泳检测:制作SDS-PAGE凝胶后将上述提取得到的蛋白上样跑电泳，转膜，5%的脱脂奶粉封闭后用对应的一抗孵育，4℃过夜，之后用二抗孵育1 h后洗膜显色，即去显影，之后借助软件Image J对蛋白条带的灰度进行定量。

2）real time PCR检测mRNA表达水平:利用RNA提取试剂盒提取细胞内的总RNA，之后反转录成cDNA进行real-time PCR。

3）MPO活性检测:MPO为心肌组织髓过氧化物酶，可以指示中性粒细胞激活程度。称取心肌适宜重量后，将试剂盒试剂与组织按照9∶1混合制备5%的组织匀浆，取其中0.9 mL组织匀浆加入0.1 mL的3号试剂，充分混合后置于37℃进行水浴15 min，之后于460 nm处测定吸光度值。MPO活性=（实验组OD值-对照组OD值）/11.3×质量。

4.统计学方法 本次研究SPSS 20.0软件统计分析数据。计量资料以均数±标准差表示，多组间采用方差分析，两两比较采用LSD-t法。计数资料以频数（率）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.四组小鼠心肌梗死面积变化 在进行处理之前，四组小鼠的AAR/LV以及An/AAR差异无统计学意义（P＞0.05）；经过处理后，I/R组小鼠的AAR/LV以及An/AAR均显著高于对照组（P＜0.001），DMOG+I/R组相比I/R组，AAR/LV以及An/AAR均发生了显著降低（P＜0.001），YC-1+I/R组相比I/R组，AAR/LV以及An/AAR又均发生了显著升高（P＜0.01），具体见图1。

2.四组小鼠相关蛋白表达情况 当小鼠发生心肌缺血/再灌注时，小鼠体内的HIF-1α蛋白水平显著下调（t=6.585，P=0.000 1），炎症因子NF-κB和TLR4显著上升（t=8.236，7.119，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD显著下降（t=7.266，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax显著升高（t=8.012，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平显著下降（t=12.437，P=0.000 1），表明心肌细胞发生氧化应激发生炎症反应，并诱发凋亡；而当在此基础上加入HIF-1α增强剂DMOG时，可以使炎症因子NF-κB和TLR4显著下调（t=8.557，9.015，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD显著上升（t=6.232 3，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax显著下降（t=9.117，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平显著升高（t=11.546，P=0.000 1），加入HIF-1α抑制剂YC-1现象相反（分别为t=4.279，3.927，3.108，4.217，4.538，P=0.002 3，0.004 8，0.002 9，0.000 1，0.002 1），表明HIF-1α有利于保护心肌细胞，具体见表1。

3.四组小鼠相关基因mRNA水平 经过处理后，I/R组小鼠的NF-κB和TLR4水平显著升高（t=4.687，5.124，P=0.000 1），DMOG+I/R组相比I/R组，其NF-κB和TLR4水平发生显著下降（t=4.112，4.197，P=0.000 1，0.000 1），YC-1+I/R组相比I/R组，其NF-κB和TLR4水平发生显著回升（t=2.335，2.138，P=0.000 1，0.000 1），具体见表2。

4.四组小鼠心肌组织MPO活性 经过处理之后，对照组小鼠的MPO活性为（0.28±0.54），I/R组小鼠的为（1.45±0.31），显著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R组的为（0.88±0.23），相比I/R组发生了显著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R组的为（1.98±0.39），相比I/R组发生了显著回升（t=3.015，P＜0.05），证明HIF-1α的存在可以抑制中性粒细胞的活性。

讨 论

对于心肌细胞而言，缺血，缺氧，氧化应激等容易引起心肌细胞损伤和凋亡，与其他种类的心血管疾病相比，I/R所导致的心肌梗死是造成心衰的主要原因，并具有较高的致死率，这是由于I/R发生时缺血的心肌细胞释放炎症性因子激活炎症反应，诱发成纤维细胞增殖和胞外基质沉积［14-16］，造成心肌炎性应激，纤维化以及凋亡。急性缺血性心脏病的治疗目的是使得血流及时迅速地回流到心肌缺血区，即再灌注，使原本造成的死亡率减半，但同时也会导致心肌细胞不可逆的损伤甚至坏死或者凋亡。最近发现［17］，心脏具有适应缺血/再灌注的能力，是一种较好的适应性反应，短时间内缺血有利于增强心脏抵抗后续缺血性损伤能力。使用七氟烷进行缺血/再灌注后处理可有效减轻再灌注的损伤，其机制在于七氟烷是在临床手术中应用广泛的吸入性麻药，可通过将线粒体KATP通道打开后对谷氨酸等一些兴奋性氨基酸的释放抑制，降低细胞内钙连受体作用的发挥。而七氟烷的后处理，有研究显示七氟烷的后处理可激活更多PI3K/Akt通路，另外通过抑制自噬极大地降低了脑缺血再灌注中发生的损伤，对大脑起到保护作用，因而将七氟烷后处理作为小鼠缺血再灌注损伤挽救的模型进行研究，探究其中起到直接影响的分子机制。当心肌细胞缺血时，PI3K被激活而进一步激活PKB，进一步磷酸化下游底物，从而减轻损伤。或者是ERK1/2通路被活化从而增强对于细胞生长，分化的调节。而研究发现［18］，线粒体膜上的非特异性通道转换孔mPTP在再灌注时受到ROS影响而开放，使细胞受到损伤。

表1 四组小鼠相关蛋白表达情况（）

表1 四组小鼠相关蛋白表达情况（）

注:与对照组对比，*P＜0.05；与I/R组对比，#P＜0.05

组别 对照组（n=10） I/R组（n=10） DMOG+I/R组（n=10） YC-1+I/R组（n=10） F值 P值HIF-1α 4.43±0.58 0.76±0.03* 7.18±0.03# 0.87±0.04# 3.272 0.0003 NF-κB 5.72±0.48 17.44±2.35* 6.67±1.22# 19.73±2.38# 3.113 0.000 1 TLR4 3.16±0.89 13.11±1.27* 4.45±0.23# 15.56±1.39# 3.074 0.000 1 SOD 15.23±1.85 4.28±0.75* 10.77±1.01# 5.29±1.33# 4.256 0.000 1 Bax 2.08±0.07 15.48±2.65* 4.82±0.84# 19.66±3.48# 2.835 0.000 1 BCL2 32.33±0.12 4.67±3.33* 29.88±1.52# 8.66±1.25# 4.117 0.000 1

表2 四组小鼠相关基因mRNA水平（）

HIF-1α在低氧条件下存在，高氧环境中被降解，被认为参与生物体低氧环境中适应性调控。而当发生炎症反应时，HIF-1α被认为与NF-κB的激活密切相关。已经有超过100种基因被发现可以作为HIF-1α的靶基因进行细胞调控，例如细胞凋亡。而HIF-1α除了在缺氧条件下表达，非缺氧状态下也有稳定表达，而其功能会受到NF-κB的调控，有研究显示若体内NF-κB表达缺失，即使创造缺氧环境并延长时间，HIF-1α也不会被激活。Toll样受体TLR4是NF-κB的上游，当发生缺血损伤时，心肌组织会释放损伤相关蛋白将TLR4激活，进而激活NF-κB，使得心肌损伤增强，由此可见，TLR4也可指示细胞的炎性应激以及受损伤水平［19］。

超氧化物歧化酶SOD是细胞内一种主要的抗氧化酶，用于清除细胞内氧化自由基，因而避免了自由基带给机体的危害。SOD水平高低可以反映细胞内氧化水平的高低。若SOD水平上升，说明活性氧水平升高，使细胞容易激发炎性应激过程。

而当凋亡信号出现时，抗凋亡蛋白BCL2表达会降低，则不能结合抑制促凋亡蛋白Bax，则Bax可结合到线粒体外膜改变其通透性［20］，最终使细胞色素c释放到胞浆中引起内源途径的凋亡。

本次研究发现，在进行处理之前，四组小鼠的AAR/LV以及An/AAR差异无统计学意义（P＞0.05）；经过处理后，I/R组小鼠的AAR/LV以及An/AAR均显著高于对照组（P＜0.001），DMOG+I/R组相比I/R组，AAR/LV以及An/AAR均发生了显著降低（P＜0.001），YC-1+I/R组相比I/R组，AAR/LV以及An/AAR又均发生了显著升高（P＜0.01），说明心肌缺血再灌注过程中心肌组织的缺血以及梗死面积增多，而当加强HIF-1α的作用时可以显著减少心肌组织缺血面积或者梗死面积的比例，当减弱HIF-1α的作用时心肌组织缺血面积或者梗死面积比例又显著上调；当小鼠发生心肌缺血/再灌注时，小鼠体内的HIF-1α蛋白水平显著下调，炎症因子NF-κB和TLR4显著上升，抗氧化蛋白SOD显著下降，促凋亡蛋白Bax显著升高，抗凋亡蛋白BCL2水平显著下降，表明心肌细胞发生氧化应激发生炎症反应，并诱发凋亡；而当在此基础上加入HIF-1α增强剂DMOG时，可以使炎症因子NF-κB和TLR4显著下调，抗氧化蛋白SOD显著上升，促凋亡蛋白Bax显著下降，抗凋亡蛋白BCL2水平显著升高，加入HIF-1α抑制剂YC-1现象相反，表明HIF-1α有利于保护心肌细胞；I/R组小鼠的NF-κB和TLR4水平显著升高（t=4.687，5.124，P＜0.05），DMOG+I/R组相比I/R组，其NF-κB和TLR4水平发生显著下降（t=4.112，4.197，P＜0.05），YC-1+I/R组相比I/R组，其NF-κB和TLR4水平发生显著回升（t=2.335，2.138，P＜0.05）；经过处理之后，对照组小鼠的MPO活性为（0.28±0.54），I/R组小鼠的为（1.45±0.31），显著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R组的为（0.88±0.23），相比I/R组发生了显著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R组的为（1.98±0.39），相比I/R组发生了显著回升（t=3.015，P＜0.05），证明HIF-1α的存在可以抑制中性粒细胞的活性。由此显示，HIF-1α可有效减轻大鼠在心肌损伤/再灌注所致的炎性损伤并避免心肌细胞凋亡，对心肌细胞起到良好的保护作用。DMOG有利于稳定HIF-1α的表达及水平，从而更好地保护心肌细胞，为临床上治疗心肌缺血药物研发提供理论以及和实践基础。