超声微泡靶向介导miR-206抑制宫颈癌生长

赵苗 赵云 刘朝奇 周军 马瑶 郑智唯 姜矜君

(1三峡大学医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443000；2武汉市第一医院超声科；3三峡大学第一临床医学院超声科)

基因治疗是近年来兴起的一种新型的肿瘤治疗方法，微小RNA(miRNA)在肿瘤的发生发展中起重要作用。miR-206参与了包括肿瘤在内的多种疾病〔1～6〕。研究证实，宫颈癌组织中miR-206表达下调，C-Met作为miR-206的靶基因，在宫颈癌组织中上调，C-Met的上调促进宫颈癌的发生发展，miR-206在宫颈癌中低表达影响宫颈癌患者的进展和预后〔7〕。因此，miR-206可能是宫颈癌的新型治疗工具，然而目前尚无运用miR-206治疗宫颈癌的相关报道。研究显示超声技术在介导基因输送中有独特的优势，以微泡作为基因载体联合超声靶向破坏微泡技术(UTMD)可以有效介导基因转染细胞从而抑制肿瘤细胞生长〔8～10〕。目前微泡介导基因治疗多停留在细胞水平，而鲜有通过体内实验证实基因治疗效果的研究报道。本研究旨在通过体内实验探讨自制的载miR-206微泡对宫颈癌生长的影响，有望为宫颈癌治疗提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1动物、试剂和设备 SPF级雌性纯系BALB/c小鼠18只，体重18～22 g，由湖北三峡大学重点实验室提供。宫颈癌U14细胞由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室提供。磷脂材料二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，美国Avanti公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG 2000，美国Avanti公司)；N,N′-羰基二咪唑(CDI，中国阿拉丁公司)、硬脂酸(Stearic，中国阿拉丁公司)；支链聚醚酰亚胺-600(PEI-600，中国阿拉丁公司)；全氟丙烷(C3F8)；DiO(美国Sigma)。基因转染治疗仪UGT1025(重庆医科大学超声影像研究所)，激光共聚焦显微镜(日本尼康公司)；扫描电镜JSM-7500F(日本电子公司)；银汞调和器；倒置荧光显微镜(日本尼康公司)；纳米粒度电位分析仪(美国Marlven)；气体交换装置(自制)。

1.2miR-206真核表达质粒的构建 NCBI查获miR-206的基因组序列，Primer 5设计PCR引物，通过 PCR扩增获得miR-206前体，琼脂糖凝胶电泳及DNA洗脱后，将PCR回收产物连接于卡那霉素抗性标记的真核表达载体pcDNA3.1上，最后将连接片段转化至感受细胞Ep100，挑取单克隆，进行卡那霉素抗性筛选，通过酶切和测序进行鉴定。

1.3载基因微泡的制备及基本性质测定 按一定的比例分别将硬脂酸、CDI、PEI-600溶解于无水二氯甲烷，采用冷乙醚沉淀、离心纯化和真空干燥制出硬脂酸-PEI600。将成膜材料DSPC、DSPE-PEG2000、PEI-600以摩尔比9∶0.5∶0.5混合溶解在三氯甲烷中，使用氮气(N2)使磷脂在试管壁上形成均匀的白色薄膜，加入Tris缓冲溶液水化超声至透明，用自制的气体交换装置将气体置换成C3F8，银汞调和器机械振荡40 s后制得空微泡，以一定比例与质粒孵育制得载基因微泡。通过血细胞计数板计算微泡浓度，激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察形态，粒径分析仪检测微泡粒径。

1.4模型构建及实验分组 体外培养宫颈癌U14细胞，于小鼠右前肢靠近背部处接种U14细胞。根据处理方式不同将建模成功的小鼠随机分为3组(每组6只)：空白对照(control)组、空微泡+超声(MB+US)组、载miR-206微泡+超声(miR-206 MB+US)组。

1.5基因治疗 当肿瘤结节直径为1 cm左右时开始治疗，将100 μg的质粒与0.2 ml的微泡(浓度为9×109/ml)室温下孵育30 min，经尾静脉注射到miR-206 MB+US组的每只小鼠体内，5 s内注射结束，同时对肿瘤结节区域进行超声辐照，辐照条件：9档，单路晶片输出声功率0.99 W，频率为1.00 MHz，占空比50%，连续辐照60 s；MB+US组尾静脉注射0.2 ml空微泡，并给予同等条件的超声辐照；control组尾静脉给予同样体积的生理盐水，不行超声处理。每隔1天治疗1次，共5次。

1.6治疗效果评价 于每次治疗前测量肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线，计算体积抑瘤率。最后一次治疗24 h后颈椎脱臼法处死小鼠，剥取肿瘤并称取瘤重，计算重量抑瘤率。4%多聚甲醛液中固定后石蜡包埋，5 μm切片，行苏木素-伊红(HE)染色，观察各组肿瘤组织病理情况。其余组织置于-80℃冰箱保存，用于行RT-PCR检测各组宫颈癌组织中miR-206的含量，及行免疫组织化学检测肿瘤组织中肝细胞生长因子受体(C-Met)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)的表达。扩增曲线呈标准S型，溶解曲线峰形尖锐，无杂峰，采用2-ΔΔCT法对数据进行分析，设control组各基因的表达量为1，计算各miR-206的相对表达倍数。

1.7统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1微泡基本特性 自制的阳离子脂质微泡粒径为(0.94±0.53)μm，浓度为0.9×109个/ml。激光共聚焦显微镜和扫描电镜下观察微泡呈球形，粒度分布均匀，分散性好，几乎所有的微泡尺寸都在5 μm以内，符合临床超声造影剂对粒径的基本要求，见图1。

A:激光共聚焦显微镜白光图(×1 000)；B：扫描电镜图(×5 000)；C:微泡粒径分布图图1 微泡基本特性

2.2模型构建 18只实验小鼠皮下注射7 d后接种部位出现米粒大的结节，各组小鼠的平均体重和平均小鼠肿瘤体积的组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组肿瘤体积及体重比较

2.3肿瘤生长情况 治疗第3～11天，MB+US组及miR-206-MB+US组肿瘤大小均显著小于control组，且miR-206-MB+US组显著小于MB+US组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。治疗结束后MB+US 组和miR-206 MB+US组的体积抑瘤率分别为(45.63±2.59)%、(85.59±16.05)%，重量抑瘤率分别为(8.56±1.68)%、(74.71±1.81)%，两组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。见表2。

2.4miR-206检测 miR-206 MB+US组中miR-206的相对含量最高(5.73±1.11)，与MB+US组比较差异有统计学意义(1.50±0.31，P<0.05)。

2.5肿瘤组织病理结果 control组和MB+US组肿瘤组织HE染色可见癌细胞排列紧密，紊乱，无极性，胞核增大且深染，胞质相对减少，miR-206 MB+US组可见片状凝固性坏死，肿瘤新生微血管密度减少，损伤最严重，见图2。

2.6免疫组化结果 C-Met、p-AKT、mTOR阳性表达的细胞胞质被染成棕黄色。见图3。miR-206 MB+US组C-Met、p-Akt、mTOR表达均显著低于MB+US组及control组(P<0.05，P<0.01)；MB+US组p-Akt表达显著低于control组(P<0.05)。见表3。

表2 各组治疗不同时间肿瘤生长情况

与control组相比:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001;与MB+US组相比:4)P<0.01

箭头所指为凝固坏死区域图2 HE染色光镜图(×200)

表3 各组C-Met、p-Akt、mTOR表达比较

与control组相比:1)P<0.05，2)P<0.01;与MB+US组相比:3)P<0.05

3 讨 论

miRNA是一种类似于siRNA的非编码小分子片段，通过碱基配对与靶基因上的mRNA结合，诱导沉默复合体(RISC)抑制靶标基因翻译或导致靶基因降解。miR-206可以通过跨膜受体蛋白Notch3、BAF53a、EGFR、血管内皮生长因子(VEGF)、间隙连接蛋白(Cx)43、细胞周期素(cyclin)D2、细胞分裂周期蛋白(Cdc)42、C-Met、细胞周期蛋白(CCN)D2抑制肿瘤的侵袭和转移〔2～7〕。由此可见，miR-206在肿瘤防治研究中有很大的潜力，可通过多种不同的靶点和信号通路干预肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、凋亡及肿瘤新生血管生成。迄今鲜有miR-206用于治疗宫颈癌的研究报道。当微泡运输基因时，利用超声波和微泡造影剂之间的相互作用及其产生的空化效应和声孔效应实现基因靶向转染，从而达到靶向基因治疗的目的〔5,8～10〕。

本实验研究以与细胞膜相似的磷脂作为微泡外膜，是利用了其熔点低，在体温条件下呈液态的特点，使脂质微泡在热力学上具有稳定性和流动性，当微泡发生较大的形态变化时不会破裂，或者即使外膜出现裂口后也可以自动融合修复。自制微泡以低溶解性和低弥散性的C3F8作为填充气体，加强了微泡的稳定性。通过在外膜材料中加入含有大量的亲水基团表面活性材料PEI-600，可以避免微泡发生融合，进一步提高其稳定性，使其有充分时间运输到靶区。粒径分布图和显微镜下图显示自制微泡粒径均一，分布均匀，分散性好。微泡制备过程中加入PEI-600不仅提高了微泡稳定性，还可以通过改变表面电荷使负电荷基因钻附在表面，保护基因不被血液中的核酸酶降解。体外孵育微泡与质粒，并经尾静脉注射入体内，利用超声对肿瘤结节区域进行局部辐照，促进miR-206转染U14细胞。干预5次后，miR-206 MB+US组肿瘤生长明显变缓，初步提示miR-206对宫颈癌的抑制作用，MB+US组对肿瘤体积及重量也有一定抑制，说明超声联合空微泡对宫颈癌生长也有一定抑制作用，可能是由于微泡发生破裂产生的能量改变血管壁和细胞膜的完整性及透通性进而损伤肿瘤细胞和肿瘤新生血管所致。各组HE染色结果提示miR-206可能参与宫颈癌细胞的增殖、凋亡和肿瘤新生血管生成。本实验实时定量PCR结果证实超声微泡成功介导miR-206转染U14细胞。本实验免疫组化结果提示C-Met、p-AKT、mTOR可能参与miR-206对宫颈癌细胞生长的调控，与既往研究结果一致〔11,12〕。

本研究自制的新型阳离子微泡具有携带和保护质粒的特性，作为一种新型的非病毒载体，微泡联合UTMD能够有效介导miR-206转染宫颈癌细胞，抑制宫颈癌生长及肿瘤新生血管形成，其机制可能与C-Met作为miR-206的作用靶点，抑制或阻断C-Met/p-AKT/mTOR信号通路有关，该技术有望成为宫颈癌治疗的新方法，并为临床失去手术治疗机会的中晚期宫颈癌患者提供一种新的治疗思路。本课题仍有一定的局限性，自制的微泡存在发生副作用的风险，包括变态反应和超敏反应，因此需要大量的动物实验和人体试验探究达到疗效的最低剂量，并推出微泡造影剂的使用指南；本实验样本量少，有待于今后扩大样本量进一步研究；miR-206抑制肿瘤生长可能受多基因调控，本实验只探究miR-206其中一个靶基因C-Met，需要进一步深入探究其作用靶点及通路。因此，大样本量的动物实验验证miR-206对宫颈癌的作用及作用通路是今后的一个研究方向。