LncRNA MUC5B-AS1在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

陈小卫,周睿卿,王顺清*

(1.暨南大学第一临床医学院血液科， 广东广州510630；2.广州市第一人民医院(华南理工大学附属第二医院)血液科， 广东广州510080)

弥漫大B 细胞淋巴瘤是临床常见的非霍奇金淋巴瘤的组织类型之一[1]，流行病学调查显示[2]，弥漫大B 细胞淋巴瘤在成人的非霍奇金淋巴瘤约占35 %～50 %，在临床治疗方面，虽然随着治疗方案的不断优化，患者的预后已经得到有效进步，但是仍有40 %的患者死于弥漫大B 细胞淋巴瘤复发[3]。长链非编码RNA (long non-coding RNAs，lncRNAs)在基因的表达和调控中发挥重要作用，有研究报道显示，lncRNAs在X染色体沉默、染色体修饰、转录干扰以及核内运输中发挥重要作用[4]。在弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展过程中，lncRNAs也发挥着重要作用。临床发现，lncRNAs MUC5B-AS1在弥漫大B 细胞淋巴瘤中的表达高于其他癌旁组织[5]，关于弥漫大B 细胞淋巴瘤中lncRNAs MUC5B-AS1表达的生物学意义也有待遇进一步研究。本研究通过对LncRNA MUC5B-AS1在弥漫大B 细胞淋巴瘤中的表达及临床意义分析，为临床治疗以及分子生物学机制研究奠定基础。

1资料与方法

1.1 一般资料

本次研究对象均来自于2014年6月至2016年7月在我院治疗的弥漫大B 细胞淋巴瘤患者106例作为研究对象，其中男性患者59例，女性患者47例，年龄平均为(56.72±2.37)岁，原发于淋巴结内患者39例，原发于淋巴结外患者67例，临床分期，Ⅰ-Ⅱ期患者55例，Ⅲ-Ⅳ期患者51例，临床实验室检查，乳酸脱氢酶异常患者66例， GCB型患者67例，non-GCB型患者39例，另选取淋巴结反应性增生患者106例最为对照组，其中，男性患者55，女性患者51例，年龄平均为(56.63±2.44)岁，两组患者的性别(χ2=0.301，P=0.582)、年龄(t=0.272，P=0.786)之间的差异不存在统计学意义，具有可比性。所有患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会论证通过。

纳入标准：①所有患者符合弥漫大B 细胞淋巴瘤诊断标准[6]；②所有患者CD20(+),治疗方案均为利妥昔单抗、阿霉素、长春地辛、环磷酰胺以及泼尼松联合治疗；③所有患者影像学检查其最少有一个病灶部位可测量在2 cm以上；④患者预计生存期大于3个月。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②存在凝血功能障碍患者；③严重心脏、肝、肾功能障碍的患者；④对本研究药物过敏的患者。

1.2 研究方法

lncRNAs MUC5B-AS1检测：获取患者的病灶部位组织后，对病灶部位组织进行研磨，研磨细胞中加入1mlTrizol试剂后，使用冰上裂解法对所有细胞进行裂解，直至观察不到细胞结构为止，收集裂解液后分别进行离心后，加入200 μl氯仿后，剧烈震荡后室温放置5 min，采用12 000 r/min离心15min后，离心结束后吸取溶解有RNA的氯仿溶液，加入预冷异丙醇200 μl后再次离心15 min，待离心管管壁张上出现白色沉淀物后即为提取的总RNA，5‘-TGTATGGACTTTGCCCACTGAG3’作为上游引物，以5′TTCAATGAGATTGTGGGAGGAG3′作为下游引物，对提取RNA进行扩增，扩增条件为94 ℃预变性5 min，58 ℃30s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。采用2-△△Ct法对细胞株的lncRNAs MUC5B-AS1含量检测。

1.3 观察指标

1.3.1 两组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达比较。

以疾病组为观察组，淋巴结反应性增生患者为对照组，比较两组患者的病灶组织lncRNAs MUC5B-AS1表达之间的差异。

1.3.2 不同病理类型观察组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达比较。

分别对观察组患者的不同疾病分期、性别、年龄、原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)以及乳酸脱氢酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况之间的差异进行比较。本研究中，以lncRNAs MUC5B-AS1相对表达量为3.11以上为高表达，3.11以下为低表达。

1.3.3 不同lncRNAs MUC5B-AS1表达情况的生存期比较。

分别对lncRNAs MUC5B-AS1高表达患者以及低表达患者的总生存期以及无进展生存期进行比较。

1.3.4 不同生存状态患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况比较。

分别对生存组患者以及死亡组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况进行比较。

1.3.5 弥漫大B 细胞淋巴瘤的COX生存分析。

采用COX生存分析对患者的不同的原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表达情况以及乳酸脱氢酶含量的影响进行多因素分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达比较

与对照组相比(3.67±1.01)，观察组患者的lncRNAs MUC5B-AS1相对表达量(8.55±2.33)显著提升，差异存在统计学意义(t=19.785，P=0.000)。

2.2 不同病理类型观察组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达比较。

通过对不同病理类型观察组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达进行比较，不同的原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)以及乳酸脱氢酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况之间的差异存在统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 不同病理类型观察组患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达比较Tab.1 Expression of lncRNAs MUC5B-AS1 in different pathological types of observation group was compared

2.3 不同lncRNAs MUC5B-AS1表达情况的生存期比较。

通过对患者开展为期3年的随访。患者随访率为100 %，lncRNAs MUC5B-AS1高表达组患者的总生存期以及无进展生存期显著低于lncRNAs MUC5B-AS1低表达组，差异存在统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 不同lncRNAs MUC5B-AS1表达情况的生存期比较Tab.2 Survival time comparison of different expression of lncRNAs MUC5B-AS1

2.4 不同生存状态患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况比较。

通过随访，观察组患者发生死亡患者75例，生存患者31例，MUC5B-AS1高表达组患者的死亡率显著高于MUC5B-AS1低表达组患者，差异存在统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 不同生存状态患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况比较Tab.3 Expression of lncRNAs MUC5B-AS1 in patients with different survival status was compared

2.5 弥漫大B 细胞淋巴瘤的COX生存风险分析

通过对弥漫大B 细胞淋巴瘤的COX比例风险回归模型的多因素风险分析，患者的原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表达情况以及乳酸脱氢酶含量均为弥漫大B 细胞淋巴瘤患者生存的独立影响因素，详见表4。

表4 弥漫大B 细胞淋巴瘤的COX生存风险分析Tab.4 COX survival risk analysis of diffuse large B-cell lymphoma

3 讨论

弥漫大B 细胞淋巴瘤是一种高度异质性的恶性肿瘤之一[7]，有研究报道显示[8]，弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展过程中基因表达的异常发挥重要作用。所以在临床研究中，及时对患者的靶向基因的筛选以及鉴定对于患者的治疗以及诊断具有积极的意义[9]。所以在临床上，及时对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的基因型表达具有重要意义。分子生物学研究认为[10]，lncRNAs在多种肿瘤性疾病的异常表达已经得到证实，同时临床证实，lncRNAs与患者的预后显著相关[11]。lncRNAs MUC5B-AS1主要通过对患者的细胞周期蛋白D1进行调监控，促进患者的肿瘤细胞的增殖，有研究报道显示[12]，弥漫大B 细胞淋巴瘤的迁移、侵袭以及转移是造成患者不良预后的关键因素。

在本研究中，弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的lncRNAs MUC5B-AS1显著高于对照组，同时，通过对患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况与病理情况的分析中，不同的原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)以及乳酸脱氢酶含量的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况之间的差异存在统计学意义，具体分析中，患者的远处转移、GCB型、肿瘤最大径在5cm以上，IPI指数在3-5之间均为lncRNAs MUC5B-AS1高表达的影响因素。而对不同的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况与患者的生存情况之间的分析中，随着患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况的升高，患者的生存期显著降低，分析认为，lncRNAs 在总的RNAs占比为80 %[13]，可通过对患者的转录调控、RNAs的加工，在弥漫大B 细胞淋巴瘤患者发生发展过程中发挥重要作用。有研究报道显示，在正常人体中，在lncRNAs MUC5B-AS1表达情况较低，但是lncRNAs MUC5B-AS1表达具有较强的组织特异性，参与机体织以及细胞功能的精密调控，在肿瘤的发生发展过程中，lncRNAs MUC5B-AS1作为肿瘤基因在疾病的增殖以及迁移过程中发挥重要作用。王贵露等[14]在对lncRNAs MUC5B-AS1与肺腺癌的发生发展过程中的关系中指出， lncRNAs MUC5B-AS1与肺腺癌患者的发生发展过程中的增殖、迁移以及浸润密切相关，而本研究中发现， lncRNAs MUC5B-AS1与患者的弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的疾病分型、疾病分期以及生存状态显著相关，进一步证实，lncRNAs MUC5B-AS1与多种肿瘤疾病的发生发展显著相关。

同时，通过对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的生存COX比例风险回归模型的多因素风险分析，患者的原发病灶、疾病类型、肿瘤最大直径、国际预后指数(IPI)、lncRNAs MUC5B-AS1表达情况以及乳酸脱氢酶含量均为弥漫大B 细胞淋巴瘤患者生存的独立影响因素，提示，在疾病的治疗过程中，可针对患者的治疗，将lncRNAs MUC5B-AS1表达作为治疗的靶点[15]，同时，通过对患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况对患者的治疗效果进行评价。

本研究还存在一定的局限性，仅仅对患者的lncRNAs MUC5B-AS1表达情况与疾病的迁移以及浸润情况进行比较，但是并未对lncRNAs MUC5B-AS1表达与疾病的具体分子机制展开分析，有待在日后的研究中进行。

综上所述，lncRNAs MUC5B-AS1表达情况在弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的发生发展过程中发挥重要作用，在弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的增殖过程中可能发挥促进作用，其可作为弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的未来治疗的靶点。