柿单宁-还原型氧化石墨烯-Pt-Pd无酶血糖传感器研究

薛叶薇，曾俊祥，赵 乐，李昊远，黄 勇，李桂银

(桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西桂林 541004)

0 引言

糖尿病特征在于血糖水平升高(高血糖)，从而导致严重的疾病，如中风、肥胖、 肾衰竭和冠心病的风险增加[1-3]。因此灵敏地检测血液中的葡萄糖有利于相关疾病的治疗[4-5]。在许多不同的葡萄糖检测技术中，电化学传感器被认为是目前最成功的葡萄糖检测方法[6-7]。近年来，随着纳米技术的发展，利用各种纳米材料(如纳米金、银、铂、量子点、碳纳米管、石墨烯等)来构建生物传感器，提高传感器灵敏度,实现化学信号到电子信号的转变[8-10]。但是，针对其关键的技术研究仍然无法满足市场的需求，尤其是葡萄糖传感器[11]。还原氧化石墨烯(RGO)是一种性能优异的碳纳米材料，具有独特的电子、物理、机械和化学性质，因此被广泛用于物理和化学领域[12-13]。然而，由于其分子间π-π堆积较强，RGO容易产生团聚和夹层，从而影响分散，阻碍了进一步的应用[14]。柿单宁(PT)提取于柿子，是一种水溶性和低成本的天然生物聚合物，可通过π-π和静电相互作用吸附在RGO表面上，以防止聚集来获得更好的稳定性[15-16]。

本研究通过抗坏血酸还原法制备柿单宁-还原型氧化石墨烯-铂-钯合金(PT-RGO -Pt-Pd)纳米复合材料。然后用滴涂法将PT-RGO-Pt-Pd修饰到金电极表面，构建了基于PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料的新型无酶血糖传感器，对葡萄糖进行检测。通过柿单宁来阻止石墨烯产生团聚促进其分散，从而提高了Pt-Pd纳米粒子对葡萄糖的催化活性。利用Pt-Pd纳米粒子良好的电催化能力，RGO的高导电性和PT的良好生物相容性，通过相互协同作用获得更优异的性能。该传感器对葡萄糖的检测具有灵敏度高、选择性、稳定性好和响应时间短等特点，可用于对临床样品的检验。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)；电化学测量采用三电极系统：修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极；扫描电子显微镜(SEM，Quanta 200，Elementar，德国)；X射线衍射(XRD，D8 Advance，德国)。柿单宁(广西德坤农品有限公司)，氧化石墨烯(GO)(南京先丰纳米材料科技公司)，氯铂酸(H2PtCl6)、硝酸钯(Pd(NO3)2)和抗坏血酸(AA)均购自国药集团化学试剂有限公司。实验中所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料的制备

将10 mL 0.1 mg/mL的GO超声搅拌2 h形成匀的悬浮液，然后缓慢加入10 mg AA并搅拌12 h获得还原氧化石墨烯。接着将20 mg的柿单宁加入10 mL 0.1 mg/mL RGO分散液，超声约90 min获得均匀良好分布的PT-RGO悬浮液。最后，将2 mL 0.01 g / mL H2PtCl6和2 mL 0.05 g/mL Pd(NO3)2溶液加入到RGO-PT悬浮液中，再缓慢加入10 mg AA并搅拌20 h，随后将混合溶液离心15 min 10 000 r/min，去除上清液，用超纯水洗涤3次，得到PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料，干燥后储存4 ℃的冰箱中备用。

1.3 无酶葡萄糖传感器的构建

首先将金电极依次用粒径为1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光，在乙醇和蒸馏水中分别超声5 min，冲洗后置于0.5M的H2SO4溶液中进行电化学循环伏安扫描活化10圈，再用0.1M的 PBS充分洗涤；将5 μL 0.1mg /mL PT- RGO-Pt-Pd 溶液滴加到抛光后的金电极表面并在室温下晾干；滴加3次PT- RGO-Pt-Pd溶液后，得到基于PT-RGO-Pt-Pd复合纳米材料的无酶葡萄糖生物传感器。

1.4 葡萄糖的检测

采用三电极体系，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，修饰后的金电极为工作电极，0.1 M PBS (pH为7.4、含0.1 M KCl)为电解质溶液，利用电化学工作站，采用电流-时间法(i-t)进行葡萄糖的计时响应测量。在测量过程中，连续滴加一定浓度的葡萄糖，工作时间为300 s，间隔时间50 s，同时通过磁力搅拌器搅拌溶液。

2 结果与讨论

2.1 PT-RGO-Pt-Pd材料及传感器的表征

图1为石墨烯和PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料的扫描电镜图。由图1(a)可以观察到石墨烯材料呈片状结构，图1(b)可以看到膜状的物质包裹着许多白色的球状物体，该薄膜为PT-RGO复合材料，而白色球状颗粒则为Pt，Pd纳米粒子且尺寸在100 nm左右，两图对比说明PT-RGO-Pt-Pd纳米复合成材料的成功制备，且分散地较均匀。

(a)石墨烯

(b)PT-RGO-Pt-Pd

为进一步验证PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料的制备成功，用XRD衍射仪对PT-RGO-Pt-Pd复合材料的晶体结构进行了分析，见图2。由图2可知，2θ= 24.9°的衍射峰对应于石墨烯的C(002)晶面。在2θ=39.7°、46.1°和67.4°处的衍射峰分别对应于Pt和Pd NPs的(111)、(200)和(220)面。由于Pt和Pd纳米粒子与同一族相匹配，因此具有相同的晶体结构。从图中可以看出，C(002)峰较强，而Pt和Pd纳米粒子衍射峰的峰值较弱，进一步确定Pt和Pd纳米粒子已经吸附在石墨烯表面，衍射峰越尖锐，表明结晶度越好。

图2 PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料的XRD图谱

图3 无酶血糖传感器的CV曲线

传感器的表征以5 mmol/L K4Fe(CV)6/K3Fe(CV)6- 0.1 mol/L KCl溶液为电解质，采用循环伏安法(CV)对裸金电极和PT- RGO-Pt-Pd复合材料修饰后的金电极进行循环伏安扫描，扫描速率为0.01 V/s，扫描电压为-0.2～0.6 V，所得循环伏安曲线如图3所示。从图3中可以看出，与裸金电极相比，PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料修饰后的金电极氧化还原峰电流值增大，电流更强。图3证明了修饰后的电极比裸电极的电子传递速率增强，PT-RGO-Pt-Pd无酶血糖传感器的构建是成功的。

2.2 检测条件对传感器性能的影响

2.2.1 体系pH对传感器性能的影响

电解质的酸碱度会影响葡萄糖的催化氧化，分别以pH=6(曲线 a)、7(曲线b)、8(曲线c)、9(曲线d)、10(曲线e)的PBS缓冲溶液作为支持电解质，采用电流-时间法(i-t)进行检测，每隔50 s滴加100 μL 0.1M 的葡萄糖溶液，所得i-t曲线如图4所示。从图4中可以看出，PBS缓冲溶液的pH在5～7之间时，相应电流值随pH的升高而增大，PBS缓冲溶液的pH在8～10之间时，虽也有电流变化，但电流逐渐变小且曲线波动较大。由此得出结论，PT-RGO-Pt-Pd/GE无酶血糖传感器的最佳体系pH值在7～8之间。

图4 不同pH值对传感器性能的影响

2.2.2 检测电位对传感器性能的影响

检测电位的大小同样会影响葡萄糖的催化，以PBS(pH7.4)缓冲溶液作为支持电解质，采用i-t进行检测，每隔50 s滴加100 μL 0.1M的葡萄糖溶液，检测电位分别为-0.1 V(曲线 a)、-0.2 V(曲线b)、-0.3 V(曲线c)、-0.4 V(曲线d)，所得i-t曲线见图5。当检测电位为-0.1 V时，电流值几乎无变化；当检测电位为-0.2 V时，电流值变化较弱，在图中不明显。当电流值为-0.3 V时，电流值变化明显且较为稳定；当检测电位为-0.4 V时，电流值虽有变化，但由于电流波动较大，所以电流变化在图中不明显，原因可能是基线不平。因此PT-RGO-Pt-Pd/GE无酶血糖传感器的最佳检测电位为-0.3 V，后续检测都在-0.3 V电位下进行。

图5 不同检测电位对传感器性能的影响

2.3 工作曲线的绘制

在PT-RGO-Pt-Pd复合材料基础上，采用无酶生物传感器促进葡萄糖的氧化，并测定在恒电位下通过i-t方法获得催化氧化电流。图6显示PT-RGO-Pt -Pd/GE在-0.3 V电位下对葡萄糖催化的电流响应曲线，50 s间隔连续添加至0.1M PBS(5次添加)。加入葡萄糖后电极迅速反应，达到95%的稳态电流小于2 s(见图6)，表明传感器对葡萄糖的反应迅速和敏感。图7显示了无酶葡萄糖生物传感器的工作曲线。在最优实验条件下，分别对不同浓度的葡萄糖进行检测，响应电流与葡萄糖浓度在0.01～0.4 mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=1.304 6x-0.001 86(y为传感器响应电流值，x为葡萄糖浓度)，相关系数为0.998 73，最低检测限为1.43 μmol/L(S/N=3)。

图6 PT-RGO-Pt-Pd/GE传感器对葡萄糖的电流响应曲线

图7 葡萄糖的标准曲线

2.4 传感器的特异性及稳定性

以抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)等为干扰物质，将其添加到葡萄糖溶液中，按照最佳条件进行电化学检测，并计算干扰物质对葡萄糖响应电流值的影响，如图8所示。结果表明，在特异性实验中，抗坏血酸对响应电流值的影响为1.66%，L-多巴胺对响应电流值的影响为2.25%，尿酸对响应电流值的影响为0.60%，二羟基苯乙酸对响应电流值的影响为2.25%。所加入的干扰物质对构建的无酶血糖传感器的影响较小，尤其是尿酸，对电流的干扰仅仅为0.60%，表明该传感器有较强的抗干扰能力。

图8 干扰物质对PT-RGO-Pt-Pd/ GE无酶血糖传感器的影响

在最优条件下将3个在相同条件下制备的PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料修饰的金电极，置于湿润环境下4 ℃冰箱保藏，隔5 d测试，检测其对葡萄糖的安培响应，结果显示在储备时间达到20 d时，响应电流仅下降到初始值的80%，表明该传感器具有良好的稳定性。

3 结论

以柿单宁为成膜物质，通过抗坏血酸直接还原制备PT-RGO-Pt-Pd纳米复合材料。基于RGO-PT纳米杂化体的良好的生物相容性和电子转移能力以及Pt-Pd纳米粒子高效的催化性能，开发了一种基于PT-RGO- Pt-Pd/GE新型的无酶葡萄糖生物传感器。该无酶葡萄糖传感器的响应电流与葡萄糖浓度在0.01～0.40 mol/L 范围内呈良好的线性关系，最低检测限为1.43 μmol/L，响应时间2 s。这种新颖的无酶血糖生物传感器灵敏度高、选择性好、稳定性强，有望应用于临床实际样本的检测，为糖尿病中的血糖检测提供高灵敏度、高选择性的快速检测方法。