茉莉酸甲酯对木豆不定根染料木素含量及抗氧化系统影响

党士坤 王胜芳 史 森 韩淑兰 王慧梅

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

木豆(Cajanuscajan(L.) Millsp.)为豆科(Leguminosae)木豆属(Cajanus)植物，广泛分布于热带和亚热带地区，是一种多用途木本豆类作物，可食用。现代研究表明木豆具有多种药理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等。黄酮类化合物是木豆中主要的有效药用成分，其中染料木素是木豆根中一种重要的异黄酮类化合物[1～2]，作为临床治疗药物，食品添加剂和营养制品得到了广泛应用[3～4]。

不定根培养具有高效率，材料来源稳定，培养条件可控及高重复性等优点。将不定根培养用于药用植物培养上可以克服药用植物有效成分含量低，不稳定的缺点，同时可源源不断地为生产提供原料。研究表明在植物组织培养中添加诱导子可以改变细胞的代谢强度，提高植物细胞中特定次生代谢产物含量。诱导子被用于各类植物细胞培养中，以促进代谢产物的合成[5]。茉莉酸甲酯(MJ)作为一种常用的诱导子，对多种代谢产物合成具有促进作用[6～7]，MJ处理提高了丹参毛状根中丹参酮的含量，促进了黄芩毛状根中黄芩苷的合成，使刺五加不定根中的刺五加苷含量增加[8～10]。

本研究在已建立木豆不定根培养的基础上，研究了诱导子MJ对木豆不定根中染料木素含量的影响，并对其抗氧化系统进行了研究，以期为木豆不定根的大规模培养提供理论指导和基础数据。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 木豆不定根来源

将木豆种子用70%酒精消毒30 s，然后在4%的次氯酸钠中消毒2 min，无菌水冲洗3次，并用无菌滤纸吸干木豆表面水分，接种于MS固体培养基培养，待无菌苗生长到12 d剪取生长状态良好的不定根，用无菌水冲洗掉表面的琼脂并接种于1/2MS液体培养基里培养，进行诱导子实验。

1.1.2 木豆不定根处理

准确称取1.1.1中培养的生长状态良好的不定根0.5 g接种在新鲜的1/2MS液体培养基中培养15 d后，分别加入0,50,100,200 μmol·L-1MJ，培养0，24，48，72，96 h后分别取样，将一部分不定根烘干，用于检测染料木素含量，另一部分迅速在液氮中冷冻，然后放入-80℃的冰箱中进行保存，用于生理生化指标的测定，每个处理重复3次。

1.2 研究方法

1.2.1 木豆不定根中染料木素的测定

干重为0.2 g的木豆不定根样品加入8 mL 70%乙醇超声提取1 h，重复提取3次，离心后合并上清液，浓缩后利用高效液相色谱法进行测定。

使用的HPLC系统由Waters1525高效液相色谱仪、Waters2478检测器和Waters SunFireC18色谱柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)组成。流动相为甲醇∶水∶甲酸=65∶34.935∶0.065(V∶V∶V)，流速为1 mL·min-1，进样量为10 μL，柱温30℃，检测波长260 nm。测得的标准品的标准曲线方程为Y=152.68X+1 086.8(R2=0.996 2)，通过标准曲线的方程来计算染料木素的含量[13]。

1.2.3 不定根中抗氧化酶活性的测定

粗酶液的提取：称取0.4 g鲜样，加入8 mL pH为7.8的50 mmol·L-1的磷酸缓冲液。冰浴研磨后，4℃，6 000 r离心10 min，上清液即为酶液，转移到另一试管备用。

POD酶活性测定采用愈创木酚比色法测定[15]，CAT酶活性测定采用过氧化氢还原法测定，SOD酶活性测定采用NBT还原法测定[16]。

1.4 数据分析

实验结果采用SPSS 22.0统计软件进行数学统计分析，多重比较采用Duncan法，利用excel软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 MJ对木豆不定根次生代谢产物的影响

2.1.1 不同浓度与时间的MJ对木豆不定根染料木素的影响

由图1可以看出，MJ对木豆不定根染料木素的合成有明显的促进作用，同时也可以发现其浓度和处理时间对染料木素合成有重要影响，200 μmol·L-1MJ处理和对照相比，作用效果不明显。50与100 μmol·L-1的MJ处理对不定根染料木素合成有明显促进作用，100 μmol·L-1的MJ处理48 h时,不定根中染料木素积累量达到最大值为1.39 mg·g-1，约为对照组的4.03倍。

图1 MJ不同浓度与不同时间的处理对木豆不定根染料木素含量的影响Fig.1 Effects of different concentrationand time of MJ treatment on genistein content in the adventitious roots of pigeon pea

图2 MJ处理对木豆不定根活性氧的影响Fig.2 Effect of MJ treatment on reactive oxygen speciesin adventitious roots of pigeon pea

2.2 MJ对木豆不定根活性氧产生和抗氧化酶活性的影响

2.2.1 MJ处理对木豆不定根中活性氧的影响

2.2.2 MJ处理对不定根中抗氧化酶的影响

如图3所示，当MJ浓度为100 μmol·L-1时，随着处理时间的增加，POD活性从24 h开始增加明显，在此之后随处理时间的增加，POD活性维持在较高水平，在48 h时达到最大值为13.17 U·g-1·min-1为对照组的1.6倍。CAT活性也有所提高，在处理时间为72 h时，达到最大值77.12 U·g-1·min-1为对照组的1.38倍。SOD活性随处理时间的增长先升高后下降，在48 h时达到酶活性的最大值82.54 U·g-1为对照组的1.2倍。

图3 MJ处理对木豆不定根POD、CAT及SOD酶活性的影响Fig.3 Effect of MJ treatment on POD, CAT and SOD activity in adventitious roots of pigeon pea

2.3 讨论

次生代谢产物是植物在进化中与环境相互作用产生的保护自身的物质，近年来大量研究表明，非生物诱导子可以调节特定基因表达，从而调节植物代谢过程[17～18]。通过在植物组织培养中添加诱导子进行次生代谢产物的合成已经引起越来越多国内外学者的关注[19]。MJ处理后人参毛状根中三萜皂苷含量提高[20]。MJ处理喜树细胞悬浮培养液增加了喜树碱的积累[21]。我们的研究也得到了类似的结果，MJ明显促进了木豆不定根染料木素的合成，而且这种促进作用受MJ的浓度和作用时间的影响，当MJ的浓度达到200 μmol·L-1时，和50和100 μmol·L-1的处理相比，染料木素的合成能力明显降低，说明较高浓度的MJ对木豆不定根染料木素的合成起到了一定的抑制作用。

3 结论

诱导子MJ能明显促进木豆不定根染料木素的合成，且受浓度和处理时间的影响，诱导子MJ处理过程中，木豆的不定根发生了明显的氧化胁迫，抗氧化酶起到了一定的保护作用，但不足以消除活性氧的影响，这种氧化胁迫导致了次生代谢产物的合成。