山银花绿原酸提取工艺的优化及不同时期绿原酸的含量

赵佳利，张晓娜，黄 娟，邓 娇

(贵州师范大学 荞麦产业技术研究中心，贵州 贵阳 550001)

山银花为忍冬科植物红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMip.)、灰毡毛忍冬(L.macranthoidesHand.-Mazz.)、华南忍冬(L.confusaDC.)和黄褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)的干燥花蕾或带初开的花[1]。山银花是一种植物类抗生素药材，是国家重点发展的名贵中药材，为“银翘片”中成药的主要原料。山银花主要含有绿原酸、三萜类和黄酮类化合物[2]，广泛作为食用、药用及化妆、保健品生产原材料，在我国具有很大的市场潜力，故有广阔的种植前景。作为山银花主要有效成分的绿原酸，与该植物的药用价值和临床疗效紧密相关[3]。目前，绿原酸的含量是评价山银花质量的重要指标，我国药典明确规定山银花干燥品绿原酸含量不得低于2%，含灰毡毛忍冬皂普乙和川续断皂普乙的总量不得低于5%[1]。

山银花从出花蕾至刚开花的阶段可分为幼蕾期、青花期、大白期和银花期4个阶段[4]。山银花新藤茎顶部1～3位完全伸展叶为幼叶；藤茎中下部为其成熟叶，叶片呈深绿色。

童红等[5]对山银花产业现状调查的结果表明，近几年全国山银花的市场需求逐年增加，山银花生产量和需求量难以平衡，造成供不应求的现象。张永清等[6]研究发现，忍冬各部位以花的绿原酸含量最高，叶的其次；8～9月叶中绿原酸含量最高，同一生长期叶的绿原酸含量约为花的60%～70%。武雪芬等[7]研究发现，越冬老叶的绿原酸含量约为花的1.41倍。叶片作为生产山银花的副产品，在山银花种植、修剪过程中可大量得到，但长期以来并未引起足够重视，造成了极大的资源浪费[8]。绿原酸市场需求量逐年增加，提取绿原酸市场前景广阔、发展潜力巨大[9]。试验利用超声波提取新鲜山银花的花及叶片绿原酸的含量并了解其动态变化，旨在为山银花药材规范化栽培和采收提供理论依据，为合理评价山银花的质量以及进一步促进山银花资源的综合开发利用提供理论基础，同时也为中药材山银花的发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 山银花 以山银花处于幼蕾期、青色期、大白期、银花期的花和幼叶、成熟叶的叶片新鲜样品为研究对象。该试验材料于2018年5月中旬采摘于贵州省黔西南布衣族苗族自治州贞丰县北盘江镇(东径105°64′，北纬25°64′)。

注：1，幼蕾期；2，青色期；3，大白期；4，银花期；5，幼叶；6，成熟叶。

Note:1, young bud stage; 2, cyan period; 3, green-white stage; 4, silver florescence stage；5, young leaf; 6, mature leaf.

图1 试验用各时期山银花新鲜的花和叶

Fig.1 Fresh flowers and leaves ofLoniceraeused in the experiment at various stages

1.1.2 仪器 AR1140电子天平，上海精天电子仪器公司；微量移液器，Eppendorf(德国)；DK-98-ⅡA恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器设备厂；H-1650R离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；KS-5200DE液晶超声波器，昆山洁力美超声仪器有限公司；WH-861涡旋混合器，上海康华生化仪器制造厂。

1.1.3 试剂 绿原酸标准品，纯度级别≥98%；无水乙醇，市售；研究过程用水均为超纯水，自制。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 1)样品采集与处理。试验材料采摘后立即用液氮速冻，再用研钵研磨成粉末状，存于-80 ℃冰箱备用。2)绿原酸标准液配制。精密称取绿原酸标准品10 mg置于10 mL容量瓶，加入无水乙醇溶液定容至10 mL，摇匀得1 mg/mL的绿原酸标准液。使用时用移液器精密吸取1 mg/mL的绿原酸标准液1 mL于试管中，再加无水乙醇至20 mL，摇匀即得0.05 mg/mL的绿原酸标准液。

1.2.2 标准曲线的绘制 分别精密量取0.05 mg/mL的绿原酸标准液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度(10 mL)，依次编号为1～7；以1号试剂溶液做参比，用紫外可见分光光度计于329 nm处测定各浓度绿原酸标准液的吸光度；以吸光度A为纵坐标，以绿原酸浓度C为横坐标进行线性回归，计算得到线性回归方程。

1.2.3 样品绿原酸的提取 根据刘欣等[10-11]的研究结果，选取影响山银花中绿原酸提取率的浸提时间、浸提液浓度和料液比等3个因素，以绿原酸提取率为评估价指标，采用L9(34)正交试验[12]进行绿原酸超声波浸提正交试验因素与水平设计(表1和表2)。精确称取山银花幼叶粉末共9份各0.5 g，分别放入50 mL离心管中并编号1～9；根据设计方案的料液比用移液器向各离心管中加入相应体积和浓度的乙醇溶液，涡旋混匀后再进行超声提取，超声频率40 kHz，功率100 W，温度为25 ℃；10 min、20 min和30 min后取出对应编号的离心管，将其放入离心机中，12 000 r/min离心10 min后取上清液至另一新的50 mL离心管中(对应编号)，然后用对应浓度的乙醇溶液定容至相应的体积；将绿原酸提取液放入-4 ℃冰箱中冷藏待用。不同发育时期花和叶中的绿原酸按照正交设计试验的优化提取方法进行提取，3次重复。吸取绿原酸提取液各0.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，再用各对应浓度的乙醇定容至刻度；然后吸取稀释后的绿原酸提取液以绿原酸标准溶液做对照，在329 nm处测定吸光度，然后计算各样品的绿原酸提取率。

表1 山银花中绿原酸浸提正交试验设计因素与水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae

水平Level因素 FactorA料液比/(g∶mL)B浸提时间/minC浸提液浓度/%11∶20107521∶30208531∶403095

表2 绿原酸浸提正交试验的设计方案

Table 2 Design scheme of orthogonal test for extraction of chlorogenic acid

处理 TreatmentABC111121223133421252236231731383219332

1.2.4 最优法提取各样品的绿原酸 采用正交试验确定的山银花浸提最优条件提取不同时期花和叶中的绿原酸，3次重复。采用1.2.3的方法测定吸光度并计算绿原酸的含量。

1.3 数据统计与分析

用Excel 2016进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

2.1.1 绿原酸的标准曲线 从图2可知，绿原酸浓度在0～0.015 0 mg/mL时，其与吸光度之间存在线性关系，线性回归方程为y=69.043x-0.015 7(R2=0.998 4)。表明，线性关系良好。

图2 绿原酸的标准曲线

Fig.2 Standard curve of chlorogenic acid

2.1.2 山银花绿原酸的浸提效果 L9(34)正交试验山银花幼叶绿原酸的提取率依次为0.602%、0.459%、0.274%、0.486%、0.393%、0.641%、0.342%、1.042%和0.721%。由表3和图3可知，各因素对山银花中绿原酸提取率的影响程度依次为C>A>B，即浸提液浓度的影响程度最为显著，浸提时间影响程度最低。随着料液比增大，提取率逐渐增大，说明，提取液体积增大能促进更多的绿原酸溶出。随着浸提时间增加，提取率呈先升后降趋势，原因可能是适当延长超声提取时间可使细胞结构破碎完全，绿原酸更易溶于提取液中；但处理时间过长则可能使绿原酸结构破坏、分解或使细胞内其他杂质溶出，从而降低绿原酸提取率，与宋琳琳等[13]的结论相近。随着浸提液浓度增加，提取率随之降低，可能是溶剂浓度过高使干扰物质溶解，从而影响了提取率，与单磊等[14]的结果类似。根据上述分析可得绿原酸超声波提取的最优条件为A3B2C1，即料液比1∶40，提取时间20 min，乙醇(浸提液)浓度75 %，在此条件下山银花幼叶绿原酸提取率为1.042%。

表3 山银花幼叶绿原酸浸提L9(34)正交试验的均值与极差

Table 3 Mean value and range of L9(34) orthogonal test for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae%

数据来源 Data sourceABCk10.4450.4770.762k20.5070.6310.555k30.7020.5450.337极差Range0.2570.1550.425

注：表中ki为因素A、B和C的第i(i=1，2，3)水平的提取率。

Note:Thekiin the table is the extraction rate at thei(i= 1,2,3) levels of the factors A, B and C.

图3 山银花浸提各影响因素与绿原酸提取率关系

Fig.3 Relationships of extraction rate of chlorogenic acid with factors influencing extraction ofLonicerae

2.2 不同时期花和叶中绿原酸的含量

从图4看出，幼蕾期、青色期、大白期、银花期的花和幼叶、成熟叶的绿原酸含量分别为9.074 mg/g鲜重、10.415 mg/g鲜重、2.033 mg/g鲜重、2.252 mg/g鲜重和2.432 mg/g鲜重、8.520 mg/g鲜重。其中，成熟叶、幼蕾期和青色期花中的绿原酸含量均较高且相近，幼叶、大白期和银花期花的绿原酸含量相近且相对较低，可能是因为幼叶组织尚未成熟，叶绿体合成有机物的量较少，而随叶片发育有机物合成量增加，从而促进了绿原酸的生成；幼蕾期和青色期的山银花主要呈绿色，随花蕾的发育其颜色由绿色转为白色，在青色期后的发育过程中花蕾中叶绿体和有机物含量减少导致了绿原酸含量锐减。与耿世磊等[15]的研究结论相吻合。

图4 各时期花与叶的绿原酸含量

Fig.4 Chlorogenic acid content in flowers and leaves at various stages

3 讨论与结论

该研究利用正交试验优化得到山银花中绿原酸的最佳提取工艺：料液比 1∶40，提取时间20 min，乙醇(浸提液)浓度75%。超声波能将细胞壁击碎，使其内容物更易溶入提取液中，从而提高绿原酸的提取率；绿原酸因含有邻二酚羟基，结构不稳定，高温及长时间提取可造成绿原酸的分解，因此，要求绿原酸提取过程中温度不能过高，75%乙醇提取过程中温度稳定在25℃，可保证绿原酸处于稳定状态利于提取，从而有效提高绿原酸的提取率且乙醇易回收。该研究结果不仅是该研究的重要前提，使观测值绿原酸含量接近山银花中的真实值；也为如何更有效更经济地提取山银花中的绿原酸提供了方法，并为有效提高山银花中绿原酸资源的利用率奠定了基础。该优化工艺运行成本低，操作简便易行，对绿原酸类热敏性物质的提取具有重要意义。

研究结果表明，各时期山银花平均绿原酸含量为5.944 mg/g FW，各时期叶片平均绿原酸含量为5.476 mg/g FW，山银花的绿原酸平均含量略高于叶片。山银花青色期时的绿原酸含量最高，随着花蕾发育其绿原酸含量呈升高趋势，至青色期达最高，而后迅速降低，在大白期其绿原酸含量已降至青色期的20%左右，随后绿原酸含量趋于平稳状态。成熟叶和幼蕾期山银花的绿原酸含量接近，幼叶绿原酸含量低于成熟叶并且与银花期的含量相近。如果入药过程中只追求药材的绿原酸含量，理论上应在山银花的青色期及时进行采收，以期获得最大的药用利用价值，并可兼顾山银花的有效成分和产量。在绿原酸含量方面，山银花叶和花之间具有相似性，说明，山银花的叶也极具开发利用价值，在某些方面可以用山银花的叶代替山银花。但是，忍冬叶的药用价值临床应用较少。吴飞燕[16]对山银花枝叶进行兽用质量标准研究的结果表明，叶作为药材的副产物，和原药材花具有相似的有效成分和药理作用。从该研究结果可以看出，山银花的叶在兽药领域或动物饲料领域存在一定的利用前景，一方面可以缓解山银花的供需压力，节约和有效利用山银花资源，减少动物用药与人类用药的冲突；另一方面对山银花种植户而言，也是增加种植山银花收入的一种方式，种植户积极性提高也可促进山银花产业的发展。