质谱分析浓香型白酒洋河梦之蓝（手工班）微量成分的研究

杜 然，郭律均，闫建斌

（清华大学生命科学学院，生物信息学教育部重点实验室，合成与系统生物学研究中心，北京100084）

中国白酒是我国传统文化的重要组成部分。窖池固态发酵和混合酒曲等制作工艺的采用使中国白酒含有丰富的微量成分[1-5]。研究显示，白酒中的乙酸乙酯等酯类以及醇、酚、酸、缩醛、醛酮、萜类、硫化物等微量物质的存在对白酒的风味、滋味及健康功效都具有重要影响[4，6-8]。

梦之蓝（手工班）是洋河酒厂股份有限公司生产的高端白酒之一。该酒采用了低温入池、低温发酵、低温馏酒的“三低”生产工艺；该工艺可为微生物的生长代谢提供更适宜的条件，可增加白酒中的微量成分。

利用色谱-质谱联用技术，我们分析了梦之蓝(手工班)中微量成分的种类。结果显示，可检测到1100个不同物质的信号峰，基于数据库可定性454种不同类物质；200～350 Da的物质含量占总检出物质含量的73.1%；其中，既包括酯、脂肪酸、醇和酮等白酒中常见呈味物质，还包括吡嗪、萜、核苷、内酯、吡唑等较少检出的物质。这些结果说明该酒含有丰富的微量成分，为深入研究绵柔型白酒的风味成因及健康效应奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：洋河梦之蓝(手工班)由江苏洋河酒厂股份有限公司提供。

试剂：氯化钠、二氯甲烷、甲酸、乙腈等购自西陇化工股份有限公司。DVB/CAR/PDMS萃取纤维及萃取装置购自美国Supelco公司。

仪器设备：安捷伦7890B-5977B气相色谱/质谱联用仪，DB-WAX色谱柱 (30 m×0.25，0.25 μm)；岛津QP2010/ultra全二维气相色谱/质谱联用仪，一维色谱柱RTX-5（30 m×0.25，0.25 μm）、一维色谱柱RTX-WAX（30 m×0.25，0.25 μm）、二维 色 谱 柱BPX-50（2.5 m×0.25，0.1 μm）、二维色谱柱 BPX-1（2.5 m×0.25，0.1 μm）；美国 Thermo公 司 DSQ TRACE气相色谱/质谱联用仪；超高压液相色谱（UPLC）和Q-Exactive Orbitrap质谱仪，C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱。

1.2 试验方法

1.2.1 易挥发物质检测方法

采用顶空固相微萃取（SPME）-气相色谱质谱（GC-MS）方法。取7 mL稀释至15%vol酒精度的白酒样品、2 g氯化钠（马弗炉烘烤）和一粒搅拌子置于15 mL顶空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纤维固相萃取后，于气质联用仪解析测定。气相色谱参数为：①岛津色谱仪：进样口温度220℃；不分流进样（加玻璃棉）；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；程序升温：35℃起始，保持3 min，再以5℃/min升到150℃保留2 min。最后以8℃/min升到220℃保持2 min。二维参数-调制解调周期6 s，液氮冷喷流量6 L/min、热喷温度350℃，持续时间350 ms。②DSQ美国Thermo公司色谱仪，进样口温度220℃；不分流进样（不加玻璃棉）；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；程序升温：70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。质谱参数为：①7890B-5977B气相色谱/质谱联用仪，传输线温度为250℃，EI源，温度230℃。电子轰击能量为70 eV，发射电流为34.6 μA，预四级杆电压为-7.8 V，采用全扫描模式，扫描范围35～500 m/z。②QP2010/ultra全二维气相色谱/质谱联用仪，传输线温度为250℃，EI源，温度230℃。电子轰击能量为70 eV，发射电流为60 μA，预四级杆电压为-3.5 V，采用全扫描模式，扫描范围50～520 m/z。③DSQ美国Thermo公司气相色谱/质谱联用仪，传输线温度为250℃，EI源，温度230℃。电子轰击能量为70 eV，发射电流为100 μA，预四级杆电压为-7.8 V，采用全扫描模式，扫描范围35～500 m/z。

1.2.2 半挥发物质检测方法

取全挥发物质测定过程中萃取的酒样，在80℃恒温条件下平衡5 min以后，用100 μM PDMS萃取纤维搅拌萃取40 min，搅拌转速为1500 r/min。之后，迅速将萃取纤维插入气质联用仪的进样口中，以220℃解吸3 min测定。气相色谱仪和质谱参数与1.2.1节相同。

1.2.3 难挥发物质检测方法

取50 mL酒样用15 mL二氯甲烷溶液萃取2次。收集萃取液，氮吹至1.5 mL，溶液转移至棕色样品瓶待测。气相色谱仪和质谱参数与1.2.1节相同。超高压液相色谱参数为：流动相为0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈；采用梯度洗脱（表1）；流速0.3 mL/min；进样盘温度4 ℃；进样量5 μL；柱温40℃。质谱参数为：喷雾电压为2.5(-)/3.5(+)，温度300℃，扫描范围100～1050 m/z。

2 结果与讨论

2.1 微量成分挥发性及分子量的分布特征

利用顶空固相微萃取（SPME）结合色谱质谱联用技术，我们检测了梦之蓝(手工班)中的微量成分，共发现1100个不同物质的信号峰，基于数据库定性出454种不同类物质，显示了该酒中含有丰富的微量成分。其中，易挥发物质共检出342种成分，占比60.6%；半挥发物质共检出约58种成分，占比10.3%；不挥发物质共检出164种成分，占比29.1%（图1）。

图1 洋河梦之蓝(手工班)微量成分的挥发性分布

按照分子量分布范围进行统计的结果显示（图2），该酒中可检出的物质主要集中于分子量小于200 Da的范围，占总检出物质的69.4%。大分子量的物质总量相对较低，分子量超过400 Da的仅检出12种，可能由于其独特的生产工艺，限制了大分子量微量成分的存在。按照色谱峰面积对检出物质的含量分布分析显示，与不同分子量范围的物质种类数量分布规律不同，其中，200～350 Da的物质含量占总检出物质含量的73.1%。

图2 梦之蓝(手工班)检出组分的分子量与含量分布

2.2 微量物质种类分析

按照化合物种类对检出物质进行分类，发现该酒的组分种类极为丰富，不仅含有大量的酯、脂肪酸、醇和酮等白酒中常见呈味物质，而且含有吡嗪、萜、核苷、内酯、吡唑等较少检出的物质。具体各类物质的种类见图3。

图3 梦之蓝(手工班)主要组分分布

2.2.1 酯类

酯类物质是白酒的重要的呈味物质之一[2，4]，洋河梦之蓝（手工班）中共检测出155种，是种类最多的化合物，主要包括直链酯、支链酯、不饱和酯、羟基酯、羰基酯等。其中，直链酯中检出的己酸乙酯和乙酸乙酯分别是浓香型和清香型白酒的主体香气成分[9-10]；不饱和酯中检出的亚油酸乙酯，具有降低血液中胆固醇和血脂的作用，多用于防治动脉粥样硬化症等代谢疾病[11]；羟基酯中检出的2，3-二羟基-(9Z，12Z，15Z)-十八碳三烯酸酯，是中药复方夏枯草中重要的活性物质，具有重要的降血压的作用[12]。

此外，在白酒中较少存在的长链酯，在洋河梦之蓝（手工班）中也有检出，这类物质可能是绵柔型白酒风味的重要来源之一[2]。我们还检出多种羰基酯物质，这些物质虽然不是主要的白酒风味物质，但却是多种风味物质的前体物质[2]，在洋河酒的呈味过程中可能发挥作用。

2.2.2 脂肪酸类

脂肪酸类物质也是中国传统白酒中重要的呈味物质之一，该酒中检测出脂肪酸类物质70种，分为直链脂肪酸、支链脂肪酸和不饱和脂肪酸。其中，已有研究显示，不饱和脂肪酸还与白酒降度后引起浑浊有着密切的关联[2，8]。在该酒中，共检出了丁烯酸、己烯酸、庚烯酸、辛烯酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等多种不饱和脂肪酸。

2.2.3 醇类

醇类是白酒风味物质的来源之一，除乙醇外，共检测出醇类物质42种，主要包括直链脂肪醇、支链脂肪醇、不饱和醇、环状支链醇和多元醇等。直链和支链脂肪醇中检出的主要为C1—C18的多种脂肪醇，是蒸馏白酒中重要的风味物质[1-2，4，13-15]。此外，该酒中检出了多种不饱和醇，不饱和醇是葡萄酒中常见的呈味组分，在白酒中较少检出[16-17]。多元醇中检出了丙二醇衍生物、己二醇衍生物、庚二醇及其衍生物和壬二醇，这些多元醇目前仅在我国绵柔型白酒中检出[2，18]。

2.2.4 酮类

酮类物质也是白酒重要的呈味物质，共检测出25种，主要包括饱和脂肪酮、羟基/羰基酮、连二酮和环酮等。其中羟基/羰基酮类物质在中国白酒中较少检出[2，15，18]，其在梦之蓝（手工班）中的作用尚待进一步的深入研究。

2.2.5 吡嗪类

吡嗪类物质主要由芽孢杆菌产生，是白酒的主要风味物质之一，同时具有重要的生物活性功能[2]。研究显示，吡嗪类物质多具有抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫力等作用[19]。该类物质检测出12种，主要包括去乙酰华蟾毒精和2，3-二甲基-5-乙基吡嗪，但其对洋河酒风味和健康功效的作用有待深入研究。

2.2.6 萜类

萜类化合物是重要的生物活性物质，具有抗炎、衰老和抗癌等多种作用[6，20]。该类化合物多见于添加中草药发酵或浸泡的药酒中[21]，但在白酒中很少检出，目前仅在清香型白酒汾酒和二锅头白酒中检出β-DMST和β-CARY等萜类物质[22-23]。洋河酒中检出萜类物质10种，主要包括半萜、一萜、倍半萜、二萜及多萜等，这些物质可能有独特的作用，有待深入研究。

2.2.7 核苷类似物

核苷类似物具有重要的抗病毒和提高免疫力的药用价值，广泛用于肝炎、艾滋病等严重威胁人体生命安全疾病的临床治疗[24-27]。洋河酒中检测出9种核苷类似物，包括2'-脱氧肌苷，5-尿苷一磷酸，2’，3’，5’-三-O-乙酰水粉蕈素，5，6-二氢尿嘧啶，6-氮杂胸腺嘧啶，5，6-二氨基-1-甲基尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶盐酸盐，2’-脱氧胞嘧啶核苷和尿苷酸。这些核苷类似物在洋河酒中的健康功效，需要进一步研究。

2.2.8 其他物质

除了以上常见种类的物质外，在本次研究中还检出了包括醛类、含硫类、内酯类等多种对白酒的风味和滋味具有较大贡献的物质。

除了以上物质，洋河梦之蓝（手工班）还含有醛类、含硫类和内酯类等对酒品的风味和滋味具有贡献的物质。其中，醛类物质反式-2，4-癸二烯醛，已发现在啤酒老化的过程中对风味变化有重要作用[2，18]；含硫类物质甲硫氨酸和胱氨酸等物质可能在洋河酒中起到了重要的呈味作用[2，27]；在葡萄酒风味中扮演重要作用的内酯类物质[2，19-20]，如丁位十一内酯等也在洋河梦之蓝（手工班）中存在；此外，还发现了乙酰谷酰胺、呋喃它酮、叔丁基对苯二酚、紫草氰苷、蟾蜍二烯内酯和妥布霉素等具有生物活性功能的物质。其中，乙酰谷酰胺属于胺类物质，研究显示，其具有改善神经细胞代谢，维持神经应激能力及降低血氨的作用，多用于脑外伤昏迷、智力减退、神经性头痛及腰痛等的临床治疗[28-29，21-24]。呋喃它酮属于酮类物质，是重要的广谱抗菌药物，广泛用于多种革兰氏阳性菌、阴性菌感染的临床治疗[30]。叔丁基对苯二酚（简写TBHQ）属于酚类物质，已有的研究显示，其在动物和植物油脂中抗氧化能力显著高于其他物质[31-32]，不仅对其他的抗氧化剂和螯合剂有增效作用，而且在其他酚类都不起作用的油脂中依然有效[32]，是非常优良的抗氧化剂。紫草氰苷属于糖苷类物质，其具有抗炎活性，临床上常用于解热解毒等[33]。蟾蜍二烯内酯属于内酯，现阶段研究发现其具有优良的抗癌活性[34]。妥布霉素属于吡喃类物质，是临床常用的重要抗生素[35]。

3 结论

本研究利用二维气质和超分辨液相质谱对洋河梦之蓝（手工班）的微量成分进行了分析，定性检出454种不同成分，包含酯、脂肪酸、醇、萜、醛、酮等多种的风味与滋味物质，还检出诸如亚油酸乙酯、叔丁基对苯二酚、乙酰谷酰胺、紫草氰苷、萜类物质、核苷类似物和吡嗪类物质等具有潜在健康功效的成分。这些结果为进一步研究梦之蓝（手工班）所含的微量成分对该酒的风味、滋味及健康效应的影响机制奠定了理论基础，也为利用微量成分的含量调控，定向改善洋河白酒的品质和健康功效提供了重要指导。