一株高效石油降解菌的筛选及降解性能研究

邢清朝，习彦花，单胜道，程辉彩，王宏伟，张丽萍

(1.河北省科学院 生物研究所，石家庄 050081;2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071000;3.浙江科技学院 环境与资源学院，杭州 310023)

石油是人类生产、生活中不可或缺的重要能源和工业原料。石油在开采、生产和运输过程中，常伴随由石油泄漏造成的环境污染。据估计，全世界范围内每年约有上千万吨的石油进入水体、土壤等自然环境中[1-3]。石油的主要成分是烷烃、苯、甲苯和二甲苯等复杂芳香烃，如进入食物链会对动物和人体造成损伤。因此，治理石油污染势在必行。石油污染处理常用的方法有物理、化学以及微生物修复法[4]，物理、化学修复一般存在成本高、操作复杂、易造成二次污染等缺点，而微生物修复则具有操作简单、作用时间长、安全等优点[5]。微生物降解石油已成为当前石油污染生物修复的重要方法之一[6-7]。因此，本文拟筛选针对降解石油的微生物，以期为环境中石油污染生物修复提供新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集

石油污染样品采自石油污染的土壤。采集距地表10 cm左右土层的土壤，装入灭菌袋中，在实验室中除去杂物，低温保存，备用。

1.1.2 石 油

石油样品取自唐海冀东油田，室温下为黑色黏稠状物，密度为0.824 g/mL，50 ℃时黏度为8.75 mm2/s，正构烷烃含量50.52%。密封保存。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(简称PB培养基)：蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏5 g/L；pH值7.0～7.2(固体培养基加1.2%琼脂粉)。Luria-Bertani培养基(简称LB培养基)：蛋白胨10 g/L，NaCL 10 g/L，酵母粉10 g/L，pH值7.0～7.2。石油培养基：无机盐基础培养基(简称MSM培养基)[8]加石油5 g/L；pH值7.0～7.5。

1.1.4 主要仪器与设备

电子分析天平A210P型，德国赛多利斯公司(Sartorius)；BIO-RAD凝胶成像系统，美国伯乐公司(Bio-Rad)；OLYMPUS光学显微镜，日本奥林巴斯公司(Olympus)；752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技公司(Thermo)；SIGMA2-16PK型高速台式离心机，美国西格玛有限公司(Sigma)。

1.2 方 法

1.2.1 石油降解菌的筛选

将5 g土壤样品加入100 mL石油培养基中，30 ℃、150 r/min摇床培养7 d，连续富集培养3次。采用平板划线法进行分离，30 ℃培养箱培养48 h。选择不同形态的单菌落，分别接种于PB固体平板，30 ℃培养箱培养48 h。对平板细菌进行涂片观察，确认无杂菌后，接种到PB固体斜面进行保存。

将纯化的单菌株于PB液体培养基中活化，吸取10 mL菌液加入到100 mL石油培养基中，对照组直接加入10 mL灭菌后的PB液体培养基，每株菌3个平行，25 ℃、180 r/min培养7 d，期间观察石油形态的变化，并于第7天测石油的降解率。

1.2.2 石油降解菌的鉴定

1.2.2.1 形态学观察 将菌株在细菌生长固体平板培养基上培养48 h，经番红染色后，用显微镜观察细胞形态[8]。

1.2.2.2 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]进行鉴定。

1.2.2.3 分子生物学鉴定 利用Ezup柱式细菌基因DNA抽提式试剂盒进行基因组总DNA的提取。将提取的DNA用于16S rDNA PCR扩增，正向引物Pf5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物Pr5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。PCR反应条件：95 ℃变性4 min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物回收、连接、转化测序由金唯智公司完成。将测序结果在GenBank上进行比对，采用MEGA6.0软件构建系统发育树。

1.2.3 石油降解性能

1.2.3.1 菌株XS -2生长曲线 将体积分数为5%的种子液接入LB培养基中，30 ℃、200 r/min摇床培养，每2 h取一次样，用分光光度计测定吸光度值(OD600)，3个重复。

1.2.3.2 石油标准曲线测定 在0.250 g石油中加入少量正己烷，溶解、定容至50 mL，配成5 000 mg/L的标准溶液。将标准液梯度稀释成质量浓度0、10、20、30、40、50、100、150、200 mg/L。在分光光度计的200～300 nm，对中间质量浓度标准液进行光谱扫描[10]，以确定最大吸收峰所用波长。在最大吸收峰波长下测定不同质量浓度标准液的吸光度，以吸光度值为纵坐标，石油质量浓度(mg/L)为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3.3 样品预处理 降解后的残油用正己烷进行萃取，在标准曲线测定条件下测定吸光度。

1.2.3.4 石油去除率计算 石油去除率=[(石油初始质量浓度-培养液石油质量浓度)/石油初始质量浓度]×100 %。

1.2.3.5 残油GC分析 在预处理残油中取1 mL用于GC检测。检测条件参照王婧[4]研究中的GC条件。

1.2.4 菌株XS -2降解石油的影响因素

图1 菌株XS -2对石油的降解作用Fig.1 Petroleum degradation by strain XS -2

分别对环境温度、石油质量浓度和培养基初始pH等影响因素进行研究，于第7天测石油的降解率，选出XS -2在各项指标中的最佳值，作为红球菌降解石油的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 石油降解菌筛选结果

通过连续富集传代培养的方法在样品中筛选出高效石油降解菌XS -2，该菌株对石油降解作用明显，如图1所示，24 h内石油完全为絮状物，形成油水混合物。

2.2 石油降解菌筛选结果

2.2.1 形态学观察

图2 XS -2菌落形态与菌体光学图片Fig.2 Colony morphology and optical photograph of strain XS -2

XS -2菌株在PB平板培养24 h，如图2(a)所示，其菌落特征为：菌落圆形、边缘整齐、不透明、表面凸起、干燥、颜色为橙红色。图2(b)是XS -2放大1 000倍菌体图片，生长前期菌体为杆状，随培养时间延长，菌体长度差异较大，变为椭球形。

2.2.2 生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]中操作方法对菌株XS -2进行以下试验项目的检测，结果如表1所示。细菌XS -2为好氧菌，不产芽孢，革兰氏染色阳性，甲基红反应阴性，V-P反应阳性，氧化酶阳性，接触酶阳性，不能液化明胶，能利用环糊精、柠檬酸盐、核糖、α-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮酸、甘露糖，不能利用阿拉伯糖和棉子糖。这与孙磊等[11]分离的赤红球菌(Rhodococcusruber)S6-2的生理生化特性基本上一致。

表1 菌株XS -2生理生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical tests of strain XS -2

注:“+”表示阳性，“-”表示阴性，“ND”表示未做检测。

2.2.3 分子生物学鉴定

通过16S rRNA测序，得到序列长度为1 500 bp左右的的基因片段，将测序结果上传GenBank，登陆号为MK380013，并与GenBank上的序列进行Blast比对，与红球菌属同源性最高，相似度达到99%。根据细菌形态、生理生化特性、16S rRNA测序结果构建XS -2的系统发育树(图3)，综合分析，鉴定该菌株为赤红球菌。

图3 菌株XS -2的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain XS -2

2.2.4 菌株XS -2的生长曲线

图4 菌株XS -2生长曲线Fig.4 Growth curve of strain XS -2

如图4所示，测定了XS -2在LB培养基中培养48 h内的生长量。结果表明，在LB培养基中，0～6 h为细菌生长的延滞期，6～16 h为对数生长期，16～44 h为生长稳定期，44 h以后细菌进入衰亡期。因此，后期试验采用培养16 h的菌液活性最高。

2.3 石油降解菌XS -2降解性能

2.3.1 最大吸收波长和标准曲线

通过紫外分光光度计进行光谱扫描发现，最大吸收波峰在224 nm处，在OD224分别测定不同标准液吸光度值，标准曲线如图5所示,相关系数R2为0.999 1，表明曲线拟合度很好。

图5 石油标准曲线Fig.5 Standard curve of petroleum

2.3.2 降解菌XS -2对石油的降解情况

图6 XS -2石油降解率 Fig.6 Petroleum degradation rate of strain XS -2

取培养16 h的XS -2菌液，按体积分数5%接种量接入LB培养基，30 ℃、200 r/min培养，在前期表现出很好的降解作用，并且与对照组相比(图6)，XS -2试验组锥形瓶瓶壁上没有明显的油膜。通过紫外分光光度法测得XS -2对石油的7 d降解率达到54.56%以上，因此可以作为石油污染生物修复的降解菌株。

2.3.3 GC分析

图7 石油GC谱图Fig.7 GC map of petroleum

如图7所示，菌株XS -2降解的石油组分在保留时间为12.80、13.91、14.21、16.79、43.12 min的波峰均出现空白缺失，这说明菌株XS -2对碳数为14、15、16和17的正构烷烃有很好的降解效果；保留时间为43.12 min的波峰缺失，但是多出保留时间为40.29 min峰面积相似的波峰，这可能是菌株XS -2将保留时间为43.12 min的物质进行了降解，具体机理有待进一步试验验证。

2.4 石油降解菌XS -2降解条件优化

2.4.1 培养温度对菌株XS -2石油降解性能的影响

图8 培养温度对降解性能的影响Fig.8 Effect of culture temperature on degradation rate

培养温度与微生物的生长繁殖、代谢活性有密切关系[12-14]。如图8所示，20～25 ℃，第7天石油降解率为30%～40%，降解率相对较低。其原因是温度较低时，细菌代谢能力受到限制，导致其代谢产物活性较低，对石油降解性能不高。随着培养温度的升高，石油降解效率显著提高，在35 ℃时达到最大值，降解率为65.13%；之后随着温度的升高降解效果明显呈下降趋势。

图9 培养基初始pH对降解性能的影响Fig.9 Effect of initial pH value on degradation rate

在35 ℃时降解效率最高，这与菌株最佳培养温度不完全一致，其原因是微生物对石油烃的降解，主要借助酶的催化作用，如环烷烃一般先被各种氧化酶氧化为醇，然后通过脱氢酶转化为酮，最后再被氧化为酯酶或脂肪酸，而酶的活性只有在一定温度范围内才能得以发挥[15]，所以石油降解温度与菌株XS -2的最适培养温度略有差异。

2.4.2 培养基初始pH对菌株XS -2石油降解性能的影响

pH过高或过低对微生物生长代谢都是不利的。如图9所示，pH值在5.0～7.0之间，菌株XS -2在第7天对石油的降解率呈上升趋势。在pH值为7.0时降解率最高达60%；之后，随着pH升高，石油降解率明显下降。这与申圆圆的研究结果一致[16]。初始pH可以影响微生物细胞内的酶活性，进而影响其生物化学过程。因此，菌株XS -2降解石油的最佳pH值为7.0。

2.4.3 石油质量浓度对菌株XS -2石油降解性能的影响

石油作为微生物生长代谢底物，其质量浓度的高低对微生物降解性能有一定的影响。由图10可知，随着石油质量浓度的升高，菌株XS -2对石油降解率呈先上升后下降的趋势，当石油质量浓度为5 g/L时，第7天降解率最高为65%。

图10 石油质量浓度对石油降解性能的影响Fig.10 Effect of petroleum mass concentration on degradation rate

石油质量浓度较低时，菌株生长底物不足，导致细菌生长缓慢，石油降解率较低，该现象与朱杰等[1]的研究结果一致。随着石油质量浓度增加，底物充足，菌株生长代谢能力旺盛，其降解率也随之提高。但并不是石油质量浓度越高越好，当石油质量质量浓度过高时，底物碳氮比失调，菌株生长受到抑制，进而使微生物对石油降解的效果显著下降。

3 结 语

微生物修复无残毒、低成本、见效快，成为解决石油污染的有效途径。本试验从石油污染的土壤样品中分离到高效石油降解菌XS -2，以石油作为唯一碳源，能有效快速地清除瓶壁上的油污，使得培养基中的石油形成油水混合物，这说明它能够快速将大分子的石油烃降解，在石油污染领域开展生物修复有较高的研究价值和较好的应用前景。经菌体及菌落形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析，鉴定菌株XS -2为赤红球菌。

微生物作为环境修复的主体，其降解效率决定修复水平[17]。因此分别对菌株XS -2的培养温度、培养初始pH和石油质量浓度进行优化，确定在培养温度30 ℃、初始培养pH值7.0、石油质量浓度5 g/L时，赤红球菌XS -2对石油的降解率最高达到65%。经GC分析，该菌可有效降解碳原子数量为14、15、16、17的烷烃。赤红球菌XS -2对石油的降解机理以及具体效果还有待进一步深入研究。