富硒碎米荠不同提取物抗氧化性能研究

杜朝东 朱 松 于 添 丛 欣 陈尚卫

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.恩施德源健康科技发展有限公司，湖北 恩施 445000)

硒作为人体必需的微量元素，具有抗氧化[1-2]、抗肿瘤[3]等生物活性。有研究[4-5]发现，硒作为体内抗氧化蛋白的重要组成部分，在清除活性氧、抑制自由基对细胞的损害等方面起着重要的作用。可以通过调节体内硒的含量来调节体内硒蛋白的活性。雷红灵等[6]发现碎米荠硒蛋白在小鼠体内能够明显地提高体内硒酶含量，降低丙二醛含量，具有较强的抗氧化活性。

堇叶碎米荠作为一种十字花科超富硒植物，其硒含量高达1 414 mg/kg，远高于富硒酵母[7]、富硒小麦[8]、富硒大豆[9]等。堇叶碎米荠幼嫩的茎叶可以食用，当植株成熟后，其硒含量达到最高，但由于此时植株具有特殊气味令人难以接受，直接食用较少[10]。有学者[11-12]通过溶剂提取方式对堇叶碎米荠进行加工利用，制得高硒含量、气味可接受的碎米荠提取物。目前对堇叶碎米荠提取物的研究主要集中在其硒蛋白的功能性及硒的形态上[13-15]，对碎米荠粗提物和碎米荠硒多肽的生物活性研究甚少。富硒物质的体外抗氧化活性是研究其生物活性重要组成部分，通过研究碎米荠富硒提取物的体外抗氧化活性，能够比较几种碎米荠提取物的抗氧化活性强弱。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

蓳叶碎米荠、富硒酵母：湖北省恩施德源健康科技发展有限公司；

氢氧化钠、硼氢化钾、铁氰化钾、氢氧化钾、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢、过硫酸钾、三羟甲基氨基甲烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

盐酸、硝酸、高氯酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸：纯度>99%，美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器设备

冷冻干燥机：SCIENTZ-10N型，宁波生物科技有限公司；

双功能水浴振荡器：SHA-B型，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；

可见光分光光度计：721N型，上海仪电分析仪器有限公司；

台式低速离心机：TD6型，湖南赫西仪器装备有限公司；

原子荧光光谱仪：AF-600型，北京瑞利分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CE的制备 将碎米荠整株烘干打粉，过80目筛，称取4.000 0 g碎米荠粉末，按照料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷50 ℃搅拌脱脂4 h，抽滤，将粉末用0.1 mol/L的NaOH溶液，按照料液比1∶40 (g/mL)在50 ℃下搅拌提取8 h，2 850×g离心10 min，上清液旋蒸浓缩4倍体积后冷冻干燥得到碎米荠提取物。

1.2.2 SPR的制备 参考1.2.1，在上清液旋蒸浓缩4倍体积后用1 mol/L的HCl溶液调节pH至等电点(pH 2.9)，4 ℃静置过夜，2 850×g离心10 min，经沉淀冷冻干燥得到碎米荠富硒蛋白。

1.2.3 SPI的制备 称取4.000 0 g碎米荠蛋白，按照料液比1∶20 (g/mL)加入去离子水，碱性蛋白酶400 μL，温度55 ℃，pH 8.0，酶解3 h，90 ℃灭酶10 min，3 000 r/min离心10 min，冷却至温度50 ℃，用盐酸调节pH至7.0，加入中性蛋白酶400 μL，酶解3 h，90 ℃灭酶10 min，3 000 r/min 离心10 min，上清液经超滤(超滤膜孔径为5 kDa)收集透过液，旋蒸浓缩4倍体积后冷冻干燥得到碎米荠多肽。

1.2.4 SPIS的制备 选用非富硒大豆肽与Na2SeO3，制备方法在文献[16]基础上略有修改，将大豆肽与Na2SeO3的质量比改为9∶1。

1.2.5 总硒含量的测定 参考GB 5009.93—2017，略有改动：负高压270 V，灯电流60 mA，辅助气流量(Ar1)300 mL/min，载气流量(Ar2)800 mL/min，原子化方式为火焰法，辅助阴极电流80 mA，原子化温度300 ℃，载流为10% HCl溶液，KBH4浓度10 g/L，读数时间15 s。

1.2.6 有机硒含量的测定 采用高效液相色谱串联原子荧光光谱仪(HPLC-AFS)的方法测定样品中的无机硒，详细条件如下：负高压320 V，原子化温度300 ℃，灯电流90/0 mA(主/辅)，泵1转速30 r/min，泵2转速20 r/min，辅助气流量(Ar1)100 mL/min，载气流量(Ar2)600 mL/min，流动相为40 mmol/L的KH2PO4和20 mmol/L 的KCl等量均匀混合，消解液为0.15%的KI溶液，载流为10% HCl溶液，KBH4浓度20 g/L，色谱柱为PRP-X100 10 μm 4.1 mm×250 mm，采用等度洗脱的方式，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃。按式(1)计算有机硒含量。

有机硒含量(mg/kg)=总硒含量(mg/kg)-无机硒含量(mg/kg)。

(1)

1.2.7 DPPH·清除率的测定 参考圣志存等[17]的方法，改动如下：用无水乙醇代替无水甲醇配置DPPH溶液，DPPH溶液浓度由0.15 mmol/L改为0.1 mol/L，将待测样品溶液与的DPPH溶液混合比例由1∶3改为1∶1。

1.2.8 ABTS+·清除率的测定 参考董竹平等[18]的方法，改动如下：将ABTS+工作液的添加量由1.5 mL增加至4 mL。

1.2.10 OH·清除率的测定 参考李亚男等[20]的方法，改动如下：在加入H2O2后，37 ℃恒温时间由30 min延长至60 min。

1.3 数据分析

每个样品设置3个平行试验，使用SPSS 23对试验数据进行数据处理，使用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同样品中总硒及有机硒含量的测定

由于样品中不同价态硒的种类众多，直接检测各价态硒的含量较为困难，所以采用HPLC-AFS法，先用HPLC将不同价态的硒分离[21]，然后经AFS测定不同价态硒的含量。由于一些含硒物质没有标准物质，且某些有机硒分离较困难，而无机硒种类较少，分离简单，所以采用总硒减无机硒的方式间接测定有机硒含量[22]。图1为5种常见硒形态的色谱分离图，其中对无机硒[Se(IV)、Se(VI)]与有机硒(SeCys2、MeSeCys、SeMet)的分离效果较好，能够对无机硒进行定量。如表1所示，通过比较每种含硒物质之间的总硒及有机硒含量差异，发现IS和SPIS的总硒含量和无机硒远远高于其他4种含硒物质，而SPI、SPR、CE和SY的有机硒含量远高于IS和SPIS，在3种碎米荠提取物中CE的有机硒含量最高，其次为SPI。通过比较每种含硒物质的总硒及有机硒含量，发现IS和SPIS未检测出有机硒，其硒的形态主要以无机硒形式存在，CE中含有少量的无机硒，而SPI、SPR和SY中的硒主要以有机硒的形式存在。说明在提取得到的含硒物质中通过纯化可降低无机硒含量，使产物中的硒以有机硒形式存在。

1.SeCys2 2.MeSeCys 3.Se(IV) 4.SeMet 5.Se(VI)

表1 不同含硒物质总硒及有机硒含量Table 1 The content total selenium and organic selenium in different selenium sources mg/kg

2.2 不同含硒物质抗氧化性

2.2.1 清除DPPH·能力 由图2所示，不同含硒物质清除DPPH·能力随硒浓度的增大而增加，清除能力强弱依次为：SPI>CE>SY>SPR>SPIS>IS。其中SPI对DPPH·的清除能力高于其他5种含硒物质且差异较大。CE、SPI、SPR和SY中硒主要以有机硒的形态存在[10]，而SPIS和IS中硒以无机硒的形态存在。另外SPI、CE、SPR、SPIS和SY的清除DPPH·的IC50分别为1 194，3 368，4 835，37 586，2 983 μg/L。说明在试验浓度范围内有机硒清除DPPH·能力强于无机硒。其中相同浓度下SPI抗氧化能力最强，可能是多肽分子量较小，活性成分充分暴露，与自由基接触，从而降低自由基含量[21]；姚昭等[22]以大鼠为试验动物，研究有机硒与无机硒的抗氧化能力的不同，发现有机硒较无机硒能明显增强大鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，显著的增强大鼠体内抗氧化能力。

图2 不同含硒物质对DPPH·清除能力比较Figure 2 The DPPH radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.2 清除ABTS+·能力 由图3所示，不同含硒物质清除ABTS+·能力随硒浓度的增大而增加，SPI、CE、SY、SPR、SPIS、IS对ABTS+·的清除能力依次减弱。SPI、CE、SPR、SPIS、SY、IS清除ABTS+·的IC50分别为914.3，2 253，11 957，42 414，10 900，160 332 μg/L。其中SPIS和IS的ABTS+·清除能力在相同浓度下相差不大，但二者的抗氧化能力均明显弱于SPI、CE、SY和SPR。所以导致其清除自由基能力较强。郑时莲等[23]也发现亚硒酸钠清除ABTS+·的能力远远低于硒酵母等物质。

图3 不同含硒物质对ABTS+·清除能力比较Figure 3 The ABTS+ radicals scavenging ability of different selenium sources

图4 不同含硒物质对清除能力比较Figure 4 The radicals scavenging ability of different selenium sources

2.2.4 清除OH·能力 如图5所示，在测定浓度范围内，6种物质对OH·的清除率随硒浓度的增加而增强，其中SPI清除OH·的能力最强，在硒含量为7 000 μg/L 时为50.3%，其次为CE，然后依次为SY、SPIS、SPR，IS对OH·清除率最低为3.7%。各组分对OH·清除能力差异较大，且以SPI清除能力最强，其中由于CE为碎米荠直接提取物，未进行分离纯化，其成分复杂，既含有蛋白、多糖等大分子物质，又含有少量多酚、黄酮类物质，可能由于其中抗氧化成分较多[25]。而SY为富硒酵母，测定时主要为其水提液中自由基清除剂与自由基反应。SPR为经纯化后的硒蛋白，具有一定能与自由基反应的基团，但其活性部位未能充分地与自由基反应，所以SPR的抗氧化能力与SPI相比要弱。SPIS和IS抗氧化能力较弱，可能是由于其中的硒为无机硒，而大豆多肽与无机硒螯合后其抗氧化能力强于同含量的大豆多肽或无机硒，但增强效果有限[26]。

图5 不同含硒物质对OH·清除能力比较Figure 5 The OH radicals scavenging ability of different selenium sources

3 结论

通过测定6种含硒物质的有机硒含量发现，SPI、SPR、CE和SY中的硒主要以有机硒存在，而IS和SPIS中主要以无机硒的形态存在。对各含硒物质进行抗氧化分析，结果表明各含硒物质均具有清除自由基的能力，且其抗氧化能力随浓度的升高而逐渐增强；在相同硒含量下，富含有机硒的物质比只含有无机硒的物质抗氧化能力强。在碎米荠含硒物质中，SPI的抗氧化活性最强，具有较高的研究和生产价值。

有机硒具有较强的抗肿瘤、抗疲劳等生物活性，而碎米荠提取物中有机硒含量较高，但对其含硒提取物，特别是硒多肽的功能性研究较少，其抗肿瘤、抗疲劳等生物活性还有待探索。