基于HPLC-Q-TOF-MS技术鉴定不同品种花椰菜叶中硫代葡萄糖苷

彭 佩 田 艳 邓放明 卿志星

(湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128)

硫代葡萄糖苷(Glucosinolate，GS)是十字花科中重要的含硫次级代谢物，由β-D-硫代葡糖、磺酸肟和来源氨基酸的侧链R组成。根据侧链R的不同，硫代葡萄糖苷可分为脂肪族硫代葡萄糖苷，芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚族硫代葡萄糖苷[1-2]。硫代葡萄糖苷的相关研究已超过150年[3]，已报道了120多种硫代葡萄糖苷[4]。硫代葡萄糖苷及其代谢产物具有显著的抗癌活性，如异硫氰酸脂具有防癌抗癌效果，尤其是对膀胱癌、结肠癌和肺癌[5]。十字花科蔬菜花椰菜含有丰富的硫代葡萄糖苷，而在以前的研究中，十字花科植株中硫代葡萄糖苷的定性定量分析主要采用高效液相色谱(HPLC)法，但HPLC法需要更多的硫代葡萄糖苷标准品，且其专一性相对于高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)较差[6]。花椰菜食用部分主要是由花蕾、花枝、花轴等聚合而成的花球，而大量未被利用的茎叶含有硫代葡萄糖苷，但其所含硫代葡萄糖苷种类以及分布情况均尚未见报道。本研究拟采用HPLC-Q-TOF/MS技术研究硫代葡萄糖苷标准品质谱裂解规律，并在质谱裂解规律的基础上对不同品种花椰菜叶中的硫代葡萄糖苷进行鉴定，为阐明花椰菜叶片中硫代葡萄糖的种类及其资源的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试花椰菜：品种包括宝塔花椰菜、青花菜和紫色花椰菜，均采自长沙市蔬菜研究所安沙实验基地。将新鲜叶片清洗后放入65 ℃隧道式烘干箱内烘3 d，待叶片彻底干燥后，放入高速中药粉碎机中粉碎，保存，备用。

无水乙醇：分析纯，上海沃凯生物技术有限公司；

乙腈：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲酸：色谱纯，天津市光复精细化工研究所；

二丙烯基硫代葡萄糖苷标准品：HPLC≥98%，美国Sigma公司；

4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷标准品：HPLC≥98%，成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱—四极杆飞行时间质谱联用仪：1290-6530型，美国Agilent公司；

电热鼓风干燥箱：101-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；

恒温水浴锅：DZKW-S-4型，北京市永光明医疗仪器厂；

高速中药粉碎机：ZN-400A型，长沙市岳麓区中南制药机械厂；

隧道式烘干机：HSW-5型，安徽省临泉县食品机械厂；

温度控制器：KSJD4-12型，上海电机公司实验电炉厂；

台式低速离心机：TD5A型，湖南赫西仪器装备有限公司；

万分之一电子天平：CP214型，奥豪斯仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫代葡萄糖苷的提取 精密称取2.0 g干燥样品置于150 mL锥形瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，70 ℃ 恒温水浴提取30 min后，4 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜后备用。

1.3.2 高效液相色谱质谱条件

(1)色谱条件：色谱柱Phenomenex C18柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；洗脱条件0～10 min，1%～3% B；10～15 min，3%～10% B；15～35 min，10%～25% B；35～60 min，25%～90% B；检测波长210 nm；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

(2)质谱条件：ESI离子源；负离子检测模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；喷雾器压力241.3 kPa；鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；毛细管电压3 500 V；锥孔电压1 000 V；扫描离子范围m/z100.00～1 200.00；二级裂解电压15～50 eV(不同硫代葡萄糖苷使用不同的裂解电压)。

2 结果与分析

2.1 花椰菜叶片提取物的总离子流图

通过HPLC-Q-TOF-MS技术获得3种花椰菜叶片中硫代葡萄糖苷提取物的总离子流图(图1)，查阅资料总结已报道的120多种硫代葡萄糖苷类化合物的结构及精确分子量，并将其[M]-及[M-H]-与花椰菜叶中存在的所有物质精确分子量进行比对，对精确分子量的误差值小于10-5的数据进行二级质谱分析并根据2种硫代葡萄糖苷标准品二级质谱裂解规律对其结构进行鉴定，最终鉴定出8种硫代葡萄糖苷(表1)，其具体鉴定依据及质谱裂解规律解析如下。

图1 花椰菜叶片提取物总离子流图Figure 1 Total ion chromatogram of extraction of Baota, Qinghua and Zise cauliflower leaves

2.2 硫代葡萄糖苷标准品质谱裂解规律

2.2.1 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷质谱裂解规律

如图2所示：① 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的侧链失去1个甲基从而形成碎片峰m/z421.053 1；② 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷侧链的第4’号碳原子(C4’)的取代基失去后和相邻碳原子上的氢(H-3')组成双键，从而在C3’与C4’组成碳碳双键，形成m/z372.052 6的碎片离子，该碎片离子继续在碳硫键(S-C1')断裂后失去硫代葡萄糖基团形成分子离子峰m/z178.025 5；③ 硫代葡萄糖苷的碳硫键(S-C1')断裂后与硫酸根离子相接形成m/z290.991 5的碎片离子；④ 碎片离子m/z259.021 0 是硫代葡萄糖苷的葡萄糖分子上的取代基硫被替换成硫酸根而形成。

表1 花椰菜叶片中的硫代葡萄糖苷Table 1 The glucosinolate in Baota Broccoli leaves,Qinghuacai leaves and Zise Broccoli leaves

图2 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解途径Figure 2 MS chromatogram of 4-(methysulfinyl)butyl glucosinolate and MS fragmentation patterns

2.2.2 2-丙烯基硫代葡萄糖苷质谱裂解规律 如图3所示：① 2-丙烯基硫代葡萄糖苷的硫与相邻碳原子发生断裂后形成m/z241.002 4，259.012 9，195.033 3，274.990 1的碎片离子[4,7-8]，葡萄糖的2号碳原子上的羟基易与硫酸根离子发生交换反应从而形成m/z241.002 4，274.990 1的碎片离子[9]；② 硫酸化的葡萄糖容易发生裂解反应从而生成m/z138.972 6的碎片离子；③ 碎片离子m/z101.027 0是2-丙烯基硫代葡萄糖苷失去1个葡萄糖和1分子磺酸盐醛肟基团后再失去硫酸根离子后所形成的；④ 碎片离子m/z161.988 7是2-丙烯基硫代葡萄糖苷的碳硫键(S-C1')断裂从而失去硫代葡萄糖基团与相邻的氢(H-2')而形成。

2.3 花椰菜叶中硫代葡萄糖苷的结构鉴定

2.3.1 3-(甲基亚磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在宝塔花椰菜叶与紫色花椰菜叶中(保留时间1.709 min)均存在此m/z422.022 4离子化精确分子量。化合物的二级质谱图[图4(a)]存在m/z259.008 0 的碎片离子，在硫代葡萄糖苷标准品裂解规律的基础上说明此化合物的结构式中有硫代葡萄糖基团，二级质谱图m/z358.025 8，116.016 9，96.959 7，74.990 5为硫代葡萄糖苷的特征离子[10-11]，此化合物的质荷比为m/z422.022 4(分子式为C11H20NO10S3)，而标准品4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的质荷比为m/z436.041 1 (分子式为C12H22NO10S3)，说明此化合物的结构式中比标准品4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷少1个CH2基团。综上所述，此化合物被初步推断为3-(甲基亚磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷，其质谱裂解如图4(b)所示。

图3 2-丙烯基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解途径Figure 3 MS chromatogram of 2-propenyl and MS fragmentation patterns

图4 3-(甲基亚磺酰)丙基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 4 MS chromatogram of 3-(methysulfinyl)propyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.2 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在宝塔花椰菜叶、青花菜叶与紫色花椰菜叶中(保留时间1.723 min)均存在此m/z436.038 7离子化精确分子量，从此化合物的二级质谱图[图5(a)]可知，其存在m/z421.016 6，372.040 4，290.971 0，259.010 7，178.017 0，96.959 7及74.990 7的碎片离子，通过与标准品4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的保留时间以及二级质谱进行比对发现，其碎片离子的质荷比在误差范围内与标准品4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷碎片离子的质荷比一致。综上所述，此化合物被确定为4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷，其二级裂解如图5(b)所示。

2.3.3 3-丁烯基硫代葡萄糖苷质谱裂解规律解析鉴定依据及质谱裂解途径 在青花菜叶中(保留时间1.737 min)存在m/z372.037 5离子化精确分子量，其二级质谱图[图6(a)]中有m/z258.999 1，96.960 2，74.990 9等特征离子，基于硫代葡萄糖苷标准品裂解规律说明此化合物的结构式中有硫代葡萄糖基团，此化合物被初步推断为3-丁烯基硫代葡萄糖苷丙基硫代葡萄糖苷，其质谱裂解如图6(b)所示。

图5 4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 5 MS chromatograms of 4-(methysulfinyl)butyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

图6 3-丁烯基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 6 MS chromatograms of 3-butenyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.4 4-羟基苄基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在宝塔花椰菜叶和紫色花椰菜叶中(保留时间1.750 min)存在m/z424.020 2离子化精确分子量，其二级质谱图[图7(a)]中有m/z116.013 1，96.959 0，74.990 6等特征离子。基于硫代葡萄糖苷的质谱裂解规律，该化合物被初步推断为4-羟基苄基硫代葡萄糖苷，其二级质谱裂解图7(b)所示。

图7 4-羟基苄基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 7 MS chromatogram of 4-hydroxybenzyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.5 1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在宝塔花椰菜叶、青花菜叶与紫色花椰菜叶中(保留时间1.994 min)均存在m/z463.046 1离子化精确分子量，化合物的二级质谱图[图8(a)]中有m/z195.031 3的碎片离子，基于硫代葡萄糖苷标准品裂解规律说明此化合物的结构式中存在硫代葡萄糖基团，m/z96.959 2，74.991 3为硫代葡萄糖苷的特征离子。综上所述，此化合物被初步推断为1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷，其质谱裂解规律如图8(b)所示。

2.3.6 3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在青花菜叶和紫色花椰菜叶中(保留时间15.094 min)存在m/z447.050 1离子化精确分子量，其二级质谱图[图9(a)]中有m/z96.958 8，74.990 9等特征离子。根据硫代葡萄糖苷的质谱裂解规律，此化合物初步推断为3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷，其质谱裂解如图9(b)所示。

2.3.7 1-含氧甲基吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在青花菜叶和紫色花椰菜叶中(保留时间18.871 min)存在m/z477.063 1离子化精确分子量，化合物的二级质谱图[图10(a)]中有m/z259.011 1，195.028 9的碎片离子，基于硫代葡萄糖苷标准品裂解规律说明此化合物的结构式中存在硫代葡萄糖基团，m/z96.959 4，74.990 7为硫代葡萄糖苷的特征离子。综上所述，此化合物被初步推断为1-含氧甲基吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷，其二级质谱裂解如图10(b)所示。

图8 1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 8 MS chromatogram of 1-hydroxyindol-3-ylmethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

图9 3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 9 MS chromatogram of 3-indolymethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

图10 1-含氧甲基吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 10 MS chromatogram of 1-methoxyindol-3-ylmethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.8 6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷鉴定依据及质谱裂解途径 在青花菜叶中(保留时间18.956 min)存在m/z479.066 1离子化精确分子量，其二级质谱图[图11(a)]中有m/z96.961 1，74.990 8等特征离子。根据硫代葡萄糖苷的质谱裂解规律，其被初步推断为6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷，其二级质谱裂解如图11(b)所示。

图11 6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷质谱图及其质谱裂解方式Figure 11 MS chromatogram of 6-(methylsulfonyl)hexyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

3 结论

通过HPLC-Q-TOF/MS技术鉴定不同品种花椰菜中的硫代葡萄糖苷，结果表明宝塔花椰菜叶中含有4种硫代葡萄糖苷,分别是3-(甲基亚磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷、4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、4-羟基苄基硫代葡萄糖苷、1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷；青花菜叶中含有6种硫代葡萄糖苷，分别是4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-含氧甲基吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷、6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷；紫色花椰菜叶中含有6种硫代葡萄糖苷，分别是3-(甲基亚磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷、4-(甲基亚磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、4-羟基苄基硫代葡萄糖苷、1-羟基-吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-含氧甲基吲哚-3-亚甲基硫代葡萄糖苷。

本研究未能检测出更多的硫代葡萄糖苷，后续将进一步对花椰菜叶中其他未知硫代葡萄糖苷的挖掘以及结构鉴定的研究。