质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

郑润泉，康继，张贵春*

(1.济南军区总医院骨创伤外科，山东 济南 250000；2.中国人民解放军71939部队，山东 济南 250300)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，在特定诱导条件下，具有多分化潜能[1-3]。比如骨髓间充质干细胞可以分化成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞等[4-7]。新近研究表明，BMSCs在特定诱导条件下可以转化成软骨细胞，进而能促进骨与软骨损伤的修复。而且BMSCs来源于患者自体，移植后可以避免排斥反应，这为临床上软骨缺损的修复提供了一个新的思路[8-10]。

既往研究表明，聚蛋白多糖(Aggrecan)与骨质密度有关，Aggrecan表达量增多时，骨质密度也相应增加，对临床老年性骨质疏松具有明显的治疗效果[11-13]。也有研究表明组织工程材料纤维多孔支架可以促进软骨缺损的修复[14-16]。然而尚未有相关研究利用骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)为种子细胞，将Aggrecan基因过表达质粒转染BMSC，并结合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架构建组织工程支架。利用基因工程和组织工程原理，充分利用两者技术优势，探究对软骨缺损的修复作用，是本研究的特色。本研究制备Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架，体外培养兔来源的骨髓间充质干细胞，构建细胞核支架的联合培养体系，体外检测骨髓间充质干细胞的成软骨转化研究，构建兔膝关节软骨缺损模型，分析其对软骨缺损的修复研究，以期为临床上软骨缺损的治疗提供思路与方法。

1 资料与方法

1.1 实验材料 胎牛血清购自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin购自美国Invitrogen公司；TRIZOL购自美国Invitrogen公司；氯仿、酒精(浓度为75%)及逆转录试剂盒购自美国ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR仪购自美国bio-rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兔来源骨髓间充质干细胞的分离和培养 兔麻醉后，消毒，铺巾，利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺针提取兔的新鲜骨髓，按照1︰3体积比加入含0.01 mol/L胎牛血清、100 U/mL青霉素DMEM细胞培养液，充分混匀后，移入25 cm2Hank培养瓶中，差速培养法培养，3 d后去掉培养瓶中的油脂等杂质，之后每3 d换一次细胞培养液。BMSCs细胞融合率达70%～80%后进行传代培养。

1.2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 采用流式细胞仪检测BMSCs表面蛋白、CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等表面蛋白的表达可以为BMSCs的鉴定提供依据。另外，采用倒置光学显微镜观察BMSCs的细胞形态。

1.2.3 慢病毒Aggrecan过表达载体的构建 慢病毒Aggrecan过表达载体是由上海吉凯公司合成，选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。慢病毒Aggrecan过表达载体的克隆切入点是XhoI/BamHI，编号为ENST00000016732。经过基因测序证明序列的正确性。

1.2.4 慢病毒细胞转染 取第2代BMSCs进行实验，将细胞接种到6孔板，待融合率为50%时进行慢病毒转染，根据转染说明书，MOI=50，慢病毒滴度为3×107μg/mL。

1.2.5 Gelatin/PLGA三维支架的制备和检测与细胞分组 将10 g明胶粉末溶解于8 mL六氟异丙醇中，玻璃棒搅拌至充分溶解。加入3 mL的聚乳酸溶液，制备PLGA质量分数为20%的Gelatin/PLGA支架材料。利用无纺布作为接收装置，利用静电纺技术制备Gelatin/PLGA纳米纤维膜，将3 g纳米纤维膜打碎，加入100 mL叔丁醇溶液中，冷冻干燥机完全冷冻后得到Gelatin/PLGA三维支架。利用扫描电镜技术检测丝蛋白支架的结构以及细胞共培养体系的检测。

1.2.6 构建兔膝关节软骨缺损模型 利用3 mL/kg的15%水合氯醛静脉内麻醉兔子。常规消毒铺无菌单，取膝关节正中侧切口，长约2 cm，逐层切开皮肤、皮下软组织、浅深筋膜，显露膝关节，使用口腔钻在兔子股骨侧软骨钻孔(长度5 mm、宽度2 mm、深度3 mm的锥形软骨缺损)，制成软骨缺损模型，生理盐水冲洗，加入干预措施后逐层缝合。

取15只成年健康新西兰大白兔，随机分为3组，每组5只。实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物；阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物；模型组造模后加入生理盐水处理。

1.2.7 免疫组织化学染色 采用SP法行免疫组化，将软骨缺损部位切片、脱蜡；PBS洗3次，5 min/次；切片室温放置30 min；PBS冲洗3次，5 min/次；用BSA室温处理10 min；加Aggrecan和Ⅱ型胶原一抗(Novus Biologicals，Littleton，美国)，4℃过夜；PBS冲洗3次，5 min/次；加辣根酶标记链酶卵白素液，孵育10 min；PBS冲洗3次，5 min/次；孵育AlexaFouor 488羊抗兔IgG二抗(Novus Biologicals，Littleton，美国)，室温放置20 min；PBS冲洗3次，各5 min；DAB显色4 min；苏木精复染2 min，倒置光学显微镜下镜检。Image J软件分析染色强度。

1.2.8 软骨缺损部位HE染色 术后1周切取软骨缺损组织，4%多聚甲醛固定30 min；脱钙处理4周；过二甲苯Ⅰ处理15min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ10 min；100%，95%，90%，85%酒精梯度处理各5min；二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ10 min，100%，95%，90%，85%酒精各处理5 min，自来水冲洗5 min，苏木素一伊红染液染色5 min；封片；倒置光学显微镜观察。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的培养和鉴定 如图1所示，接种48 h后，原代BMSCs开始贴壁，细胞成梭形或者多角形；培养至第2代后，呈旋涡状或者辐射状生长，细胞增殖迅速(见图1)；流式细胞仪检测第2代BMSCs的表面蛋白，CD29和CD34在第2代BMSCs的表达为92.6%和4.24%；CD45和CD90在第2代BMSCs的表达为3.09%和89.3%。

a 原代骨髓间充质干细胞b 第2代骨髓间充质干细胞c 第2代骨髓间充质干细胞表面蛋白CD29的表达

d 第2代骨髓间充质干细胞表面蛋白CD34的表达 e 第2代骨髓间充质干细胞表面蛋白CD45的表达 f 第2代骨髓间充质干细胞表面蛋白CD90的表达

2.2 扫描电镜下Gelatin/PLGA三维支架与骨髓间充质干细胞共培养结果 两组扫描电镜下不同视窗结构见图2，发现实验组(Gelatin/PLGA三维支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中纳米纤维膜和Gelatin/PLGA三维支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比，细胞数明显增多。

a 单纯纳米纤维膜材料+空白质粒转染BMSC生长情况b 单纯纳米纤维膜+过表达质粒转染BMSC生长情况 c Gelatin/PLGA三维支架材料+空白质粒转染BMSC生长情况 d Gelatin/PLGA三维支架材料+过表达质转染BMSC生长情况

2.3 动物模型软骨缺损组织大体结果 14 d后，将实验动物处死，取3组兔子软骨缺损大体标本，可见Gelatin/PLGA三维支架与骨髓间充质干细胞联合培养体系可以对软骨缺损有较好的修复作用，转染Aggrecan骨髓间充质干细胞后修复作用明显优于未转染组(见图3)。

2.4 兔软骨缺损组织HE染色结果 14 d后，将实验动物处死，取3组兔子软骨缺损组织行HE染色，对照组细胞结构少，支架略有降解。多为纤维性修复。实验组细胞深染，可见聚蛋白多糖转染细胞后，促进BMSC向软骨细胞转化，实验组多为软骨性细胞修复(见图4)。

a 软骨缺损大体图片 b 对照组软骨缺损修复结果 b 实验组软骨缺损修复结果

a 模型组 b 对照组 c 实验组

2.5 兔软骨缺损组织免疫组织化学染色结果 14 d后，将实验动物处死，取3组兔子软骨缺损组织化学染色，如图5所示，模型组软骨缺损明显，Aggrecan和Ⅱ型胶原表达量较少。对照组(Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞)Aggrecan和Ⅱ型胶原表达量明显增多，细胞棕色表达明显增多。实验组(Gelatin/PLGA三维支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)Aggrecan和Ⅱ型胶原表达量明显增多，细胞棕色表达明显增多(见图5)。

a 模型组聚蛋白多糖染色b 对照组聚蛋白多糖染色c 实验组聚蛋白多糖染色

d 模型组Ⅱ型胶原染色 e 对照组Ⅱ型胶原染色 f 实验组Ⅱ型胶原染色

3 讨论

本实验应用基因工程和组织工程原理，充分利用两者技术优势，体外培养兔来源的骨髓间充质干细胞，构建Gelatin/PLGA三维支架的联合骨髓间充质干细胞培养体系，探究对软骨缺损的修复作用。本研究利用静电纺法制备天然活性多孔Gelatin/PLGA三维支架，体外检测骨髓间充质干细胞的成软骨转化，修复软骨缺损的实验研究，构建兔子软骨缺损模型，探究其对软骨缺损的修复研究，以期为临床上软骨缺损的治疗提供思路与方法。

既往研究表明，利用骨髓间充质干细胞复合异种骨基质明胶可以有效修复大鼠桡骨缺损，在组织支架的诱导作用下，可以促进骨髓间充质干细胞向骨细胞转化，进而修复骨缺损[17-19]。但是这种方法需要符合特定条件的组织工程支架，也就是需要特殊的“土壤”，而骨髓间充质干细胞这个“种子”才能更好的在其内生长并且分化，临床应用的安全性有待调查[20-22]。有的学者发现，利用慢病毒构建基因载体，转染骨髓间充质干细胞后，不影响骨髓间充质干细胞的表型[23]。可见利用基因工程原理，构建基因过表达的骨髓间充质干细胞也是提高“种子”有效分化的一种手段。本研究正是立足于这一点，构建Aggrecan基因过表达质粒慢病毒载体的骨髓间充质干细胞，制作新型“基因种子”，为临床软骨缺损的研究做准备。

另外，有研究证明，抗生素/β-磷酸三钙/多孔三维支架可以修复兔桡骨骨缺损[24]。认为多孔Gelatin/PLGA三维支架具有良好的生物相容性和抗菌性。本研究采用多孔Gelatin/PLGA三维支架联合骨髓间充质干细胞共培养体系，利用扫描电镜显微镜观察Gelatin/PLGA三维支架的表面结构，发现支架表面凹凸不平，可以为骨髓间充质干细胞提供良好的黏附部位。这种发现与新近的研究相似[25]，证明了研究设计方案的可行性。从本研究的结果来看，不仅骨髓间充质干细胞可以很好黏附在Gelatin/PLGA三维支架表面，而且可以分泌细胞外基质，填充与支架间孔，为临床上软骨缺损提供良好的自体来源的细胞基质，这也是本研究的特色之一。另外，本研究发现，转染Aggrecan基因过表达载体后，干细胞分泌的细胞外基质要多，可以充填于支架间的空隙。另外，本研究体外实验中采用HE染色和免疫组织化学染色发现，转染Aggrecan基因过表达载体后，骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的效率明显提高。而且，本研究利用兔膝关节软骨缺损模型，将Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物(实验组)，Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物(对照组)植入软骨缺损部位，利用HE染色探究对软骨缺损的修复作用，而且实验组细胞向软骨细胞转化效率较高，可以实现真正的“细胞修复”，而不是平常支架所达到的“纤维修复”。可见，Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以更好地发挥修复作用。另外，本研究还检测了缺损组织Aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，发现Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进Aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，从而更好地重建细胞外基质，从细胞和细胞外基质两个层面对软骨进行修复。

综上所述，Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化，并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质，从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。