芪贞降糖颗粒与汤剂及药材谱峰匹配特征图谱

钱 程，杨青楠，丁丽玉，王浣清，张 丹，吴 飞∗，冯 怡∗

（1.复旦大学附属华东医院药剂科，上海 200040；2.上海中医药大学创新中药研究院，中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海 201203；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科，上海 200437；4.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内分泌科，上海 200437）

芪贞降糖方是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院用于治疗2 型糖尿病或糖调节异常的经验方，由黄芪、女贞子（制）、灵芝和乌梅（制）4 味中药组成，在改善患者胰岛素抵抗、调节糖代谢等方面疗效显著［1-4］。本课题组前期［5-7］系统开展了医院制剂芪贞降糖颗粒的药学研究，建立了定性和定量的质量控制方法，但尚欠缺对制剂进行整体质量控制的手段。多靶点、多组分是中药制剂独有的特点，当今对于中药制剂的质量控制正越来越多地采用药材与制剂特征图谱谱峰相结合的方法［8-10］。本研究采用高效液相色谱-二极管阵列检测法建立芪贞降糖颗粒的特征图谱，通过指认图谱中的指标性成分，比对芪贞降糖颗粒的特征图谱与组方单味药材的特征图谱主要色谱峰的保留时间，得到专属性强、重复性好的特征指标。通过本研究所建立的特征图谱，可进一步对颗粒与临床用芪贞降糖方汤剂进行物质一致性初步评价。

1 仪器与试药

Agilent 1200 型 HPLC 色谱仪（DAD 检测器，美国 Agilent 公司）；XP205 型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多科技有限公司）；SQP 型电子天平（0.1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司）；B-491 型旋转蒸发器（瑞士Buchi 科学仪器有限公司）；TGL-18C 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；SK7210HP 型超声波清洗器（上海科导超声设备有限公司）；YM-300D 型电子煎药壶（广东益美生活电器有限公司）；F2 型移液枪（美国 Thermo Scientific 公司）；Milli-Q 型超纯水机（密理博中国科技有限公司）；玻璃仪器均购自上海青阳生物科技有限公司。

乌梅（制）（批号 150826，浙江）、灵芝（批号151201，山东）、黄芪（批号 151112，甘肃）、女贞子（制）（批号151017，湖南）均购自上海康桥药业有限公司，经上海中药标准化研究中心徐红研究员鉴定为正品。特女贞苷对照品（批号111926-201404）、枸橼酸对照品（批号100396-201302）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号111920-201102）均购自中国食品药品检定研究院。3 批芪贞降糖颗粒中试产品（批号分别为1606001、1606002、1606003，20 g／袋，上海宝龙药业有限公司加工）。水为超纯水；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取特女贞苷、枸橼酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容，即得，三者稀释后质量浓度分别为0.110 4、0.539 0、0.051 6 mg／mL。

2.1.2 芪贞降糖颗粒溶液 称取颗粒4 g（相当于1 d 服用量的 10%），加水定容至100 mL，超声（350 W、53 kHz）30 min，18 000 r／min 离心 10 min，取上清液，即得。

2.1.3 芪贞降糖方汤剂 按芪贞降糖方组成（1 d 处方量）称取黄芪 12 g、女贞子（制）12 g、灵芝 15 g、乌梅（制）15 g，加水 500 mL 浸泡 15 min，煎煮 2 次，每次30 min，将 2 次滤液合并，定容至 1 000 mL，移取溶液，18 000 r／min 离心 10 min，取上清液，即得。

2.1.4 药材溶液 分别取芪贞降糖方中对应的各单味药材饮片，按其在处方中对应的处方量取样，按 “2.1.3”项下方法制备，即得。同法制备各药材饮片的阴性样品溶液。

2.2 色谱条件［11-12］ZORBAX SB-Aq Stablebond Analytical色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 0.1% 磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，0B；10～90 min，0～65% B）；进样量 10 μL；检测波长 224 nm；体积流量1.0 mL／min；柱温 30 ℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验 取颗粒（1606003）制备的供试品溶液，于 0、2、4、6、12、24 h 在 “2.2”项色谱条件下进样测定，以特女贞苷色谱峰为参照峰（S），得到各主要色谱峰的相对保留时间RSD≤ 0.24%，相对峰面积RSD≤1.35%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.2 精密度试验 取颗粒（1606003）制备的供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下连续进样6 次，以特女贞苷色谱峰为参照峰（S），测得各主要色谱峰的相对保留时间RSD≤0.18%，相对峰面积的 RSD 值≤0.74%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重 复性试验取颗粒（1606003）6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样，以特女贞苷色谱峰为参照峰（S），得到各主要色谱峰的相对保留时间 RSD ≤0.20%，相对峰面积的RSD≤1.69%，表明该法重复性良好。

2.3.4 专属性考察 取颗粒（批号1606003）、4 个单味药材及4 个对应的阴性样品溶液，在 “2.2”项色谱条件下测定，用 DAD 检测器获取并保存3D 图谱，取224 nm 波长处的谱图。4 个单味药材色谱图中均能找到与颗粒剂色谱图中保留时间一致的色谱峰，阴性对照无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 特征图谱建立［11-12］取3批颗粒（1606001～1606003）供试品溶液以及对照品溶液，在 “2.2”项色谱条件下测定，记录色谱图，应用 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件将3 批样品的色谱图导入软件，依次设定参照图谱、色谱峰校正、色谱峰匹配，得到对照图谱，见图1。在3 批样品中有 27 个共有峰，对比样品色谱图与对照品色谱图中各峰的保留时间，可指认其中3 个，分别为枸橼酸（2 号峰）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（20号峰）、特女贞苷（21 号峰）。各样品间的相似度大于0.998，与对照图谱间的相似度分别为 0.999、0.999、0.999。因此，由整体谱峰信息可知 3 批样品质量相对稳定。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.5 制剂与汤剂谱峰匹配 取 “2.1.3”项下样品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样，记录 90 min 内色谱图，并与颗粒特征图谱进行叠加，见图2。结果显示，样品与颗粒特征图谱27 个色谱峰保留时间能逐一对应，两者相似度为0.906，表明颗粒与临床用汤剂所含物质基本一致。

图2 芪贞降糖颗粒与芪贞降糖方汤剂谱峰匹配图

2.6 制剂与药材谱峰匹配 在 “2.2”项色谱条件下测定“2.1.4”项药材溶液，记录90 min 内色谱图，并与颗粒特征图谱进行叠加，见图3。结果显示，各单味药材贡献的谱峰分别为黄芪 6 个（1、3、4、14、20、25 号峰）、女贞子 12 个（1、3、5、8、9、10、11、13、17、21、22、26号峰）、灵芝 2 个（4、27 号峰）、乌梅（制）3 个（2、6、11 号峰），其中 1、3 号峰为黄芪和女贞子（制）共有，4号峰为灵芝和黄芪共有，11 号峰为女贞子（制）和乌梅（制）共有。各单味药材中的色谱峰大多数能与颗粒特征图谱对应，关联性良好，但颗粒特征图谱中大部分色谱峰都高于单味药材中，这可能与特征图谱中药材的叠加作用，以及制剂过程中的多组分助溶作用相关。

图3 芪贞降糖颗粒与4 味药材饮片谱峰匹配图

3 讨论

3.1 谱峰匹配特征图谱 本课题组采用谱峰匹配特征图谱手段对芪贞降糖颗粒开展研究，对颗粒特征图谱中的色谱-光谱可视化成分进行了来源辨析和归属，以期为制剂的进一步综合质量控制，最终为保证产品的临床疗效奠定基础。

3.2 特征图谱的应用 中药特征谱技术［13-15］是目前应用比较广泛且较受认同的中药物质基础一致性评价技术，在建立芪贞降糖颗粒的HPLC 特征谱的基础上，将中试加工的芪贞降糖颗粒与汤剂进行比较，从化学特征谱角度评价颗粒在制剂工艺条件下的加工产品与原汤剂组成一致性。

3.3 相似度评价［13-15］本研究通过HPLC 建立的3 批次芪贞降糖颗粒的特征图谱能够综合、全面地反映颗粒及颗粒中各单味药材所含化学组分。不同批次样品间相似度均高于0.998，体现了在制剂过程对颗粒及颗粒中各单味药材所含的化学组分影响较小，制剂组分整体稳定。

3.4 色谱条件优化 分别考察了 260、224、210 nm 下得到的色谱，结果表明在224 nm 下色谱图基线平稳、分离度较好、色谱峰最多、峰面积均衡，故选取224 nm 为检测波长。其次对分离条件进行了考察，筛选了甲醇-水、0.2%冰醋酸-甲醇、0.1%磷酸-甲醇3种流动相，结果表明0.1%磷酸-甲醇梯度洗脱谱峰信息较多，分离度较好。本研究建立了芪贞降糖颗粒HPLC-DAD 特征图谱，出峰数目、强度及共有峰等评价信息较好，可整体反应颗粒的物质相关特征信息。同时，结合芪贞降糖颗粒与组方单味药材特征图谱的谱峰匹配研究及指认特征峰等检测手段［16-17］，初步明确了芪贞降糖颗粒组分来源归属，使质控结果更趋合理，可更全面综合地控制制剂质量，但还需含有量测定、结构鉴定等相关研究作进一步验证。