通腑泄浊法对慢性肾脏病大鼠TGF-β1／p38MAPK信号通路的调节作用

于 翔，戴铭卉，刘 猛，包 能，孔 薇∗

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210046；2.南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210001）

肾脏纤维化是各种肾脏疾病进入终末期的必经过程，故延缓其进展对治疗慢性肾脏病而言具有重要意义。转化生长因子-β1（TGF-β1）／促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）是肾脏纤维化过程中重要的信号通路，其中前者不仅作为上游因子参与激活后者信号通路，同时活化的后者信号通路会诱导反向产物前者生成增多，故阻断该信号通路对延缓慢性肾脏病病程进展具有重要意义。

通腑泄浊法是临床常用治疗慢性肾脏病的中医疗法，通腑泄浊方是南京市中医院肾内科协定方，由生大黄、生牡蛎、熟附子、蒲公英、生槐米、六月雪组成，该方以 《黄帝内经》 中 “开鬼门，洁净府”的理论为治疗原则，紧扣 “浊毒”病机，结合传统方义和现代药理，以大黄为君药，结合诸药共奏清热利湿、通腑泄浊之功效。本实验选用通腑泄浊方及大黄作为通腑泄浊法代表方剂，观察该方法对 TGF-β1／p38MAPK 信号通路的影响及对肾脏纤维化的改善作用。

1 材料

1.1 动物 SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 30 只，体质量（200±20）g，购自浙江省动物实验中心［许可证号 SCXK（浙）2014-0001］，饲养于南京中医药大学动物中心［许可证号 SYKX（苏）2014-0001］，自由摄食饮水，封闭管理。实验前，适应喂养1 周。

1.2 试药 腺嘌呤（美国 Amresco 公司，批号0183）。大黄、牡蛎、附子、蒲公英、槐米、六月雪配方颗粒（江阴天江药业有限公司）。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，批号 ab5694）、Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ，批号 ab34710 ）、GAPDH（批号ab181602）抗体及大鼠胱抑素 C ELISA 试剂盒（批号 ab201281）（英国 Abcam 公司）；TGF-β1 抗体（美国 Santa Cruz 公司，批号 sc-130348）；p38MAPK（批号 8690S）、p-p38MAPK 抗体（批号4511S）（美国 CST 公司）；HRP 标记山羊抗兔、山羊抗鼠抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；大鼠 TGF-β1、IL-6 ELISA 试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）；硫酸吲哚酚对照品（美国Sigma 公司）。

1.3 仪器 515 型高效液相色谱仪、2475 型荧光检测器、XBridge BEH C18色谱柱（美国 Waters 公司）；MS105DU 电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ELX800 酶标仪（美国 BioTek 公司）；CKX31 倒置式生物显微镜（日本Olympus 公司）；高电流电泳仪、蛋白湿转印仪（美国 Bio-Rad 公司）；ZD-9950 脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；5810R 冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；7AN01446 纯水仪（美国 Millipore 公司）。

2 方法

2.1 造模及给药 通过SPSS22.0 软件将大鼠随机分为空白组、模型组、通腑泄浊法组、大黄配方颗粒组，其中空白组 6 只，其余 3 组各 8 只。采用Yokozawa 法建立慢性肾脏病大鼠模型，即每天上午灌胃给予2.5%腺嘌呤混悬液（200 mg／kg），第4 周周末每组随机取2 只大鼠目内眦检测 Scr、BUN 水平以评价造模情况，第5 周隔天灌胃给予2.5%腺嘌呤混悬液（200 mg／kg）以维持病程进展，至第7 周停止，在此期间空白组灌胃给予相应体积蒸馏水，同时各组大鼠下午给予相应药物治疗。根据人和动物等效剂量比值，按照成人给药剂量计算给药量，通腑通腑泄浊法组为大黄配方颗粒0.6 g／kg、牡蛎配方颗粒 0.045 g／kg、附子配方颗粒 0.15 g／kg、蒲公英配方颗粒 0.36 g／kg、槐米配方颗粒 0.54 g／kg、六月雪配方颗粒 0.09 g／kg，大黄配方颗粒组为0.6 g／kg，将上述配方颗粒溶于10 mL 蒸馏水中制成混悬液，按照 10 mL／kg 剂量每天灌胃给药，空白组、模型组大鼠下午灌胃给予等体积蒸馏水。实验过程中，模型组、通腑泄浊法组、大黄配方颗粒组均死亡2 只大鼠。

2.2 标本采集 第8 周实验结束后大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉（0.2 mL／100 g），麻醉后腹主动脉取血，保存于促分离采血管中，静置30 min 后，3 000 r／min 离心 10 min 取上清液送检。采血结束后，摘取大鼠双侧肾脏，剔除肾周筋膜组织，生理盐水清洗残余血液，于肾门处纵行剖开肾脏，4%多聚甲醛固定24 h，制作病理切片，分别进行HE、Masson 染色；其余肾脏组织置于无菌冻存管中，放入液氮备用。

2.3 生化指标检测 高效液相色谱-荧光分析法检测硫酸吲哚酚（IS），ELISA 法检测胱抑素C（CysC）、白介素-6（IL-6）、TGF-β1，委托南京中医药大学第三附属医院检验科检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、同型半胱氨酸（HCY）、24 h 尿蛋白。

2.4 肾脏病理形态学变化 多聚甲醛固定的肾脏组织进行脱水、包埋、切片后，分别进行 HE、Masson 染色，观察相关病理形态学变化。然后，Masson 染色选取图片上蓝色作为有效区域，每张切片随机选取 6 个 200 倍视野，通过 Image-Pro Plus6.0 图像分析系统对图像进行半定量分析，计算胶原纤维占整体视野面积的比例，以此作为判断肾脏纤维化程度的指标。

2.5 肾脏组织α-SMA、Col-I 蛋白表达检测 采用免疫组化技术，将石蜡包埋的切片常规脱蜡，抗原热修复后血清封闭，分别滴加α-SMA、Col-I 抗体孵育过夜，滴加二抗，显微镜下控制DAB 液显色，苏木素复染。然后，在200 倍视野下每张切片随机挑选6 个拍照，以棕黄色作为判断阳性的标准，通过Image-Pro Plus 6.0 软件分析阳性区域累积光密度值（IOD）。

2.6 肾脏 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表达检测 采用Western blot 法。取100 mg 肾脏组织剪碎，加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的裂解液，组织匀浆后静置 30 min 裂解，4 ℃ 下12 000 r／min离心 15 min，取上清液，按照 BCA 试剂盒说明书检测蛋白浓度，然后按照相应比例与SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液统一配制成蛋白上样品，煮沸10 min 使蛋白充分变性，根据说明书提示配制分离胶和浓缩胶，在泳道中加入蛋白样品，置于盛有电泳液的电泳槽中进行电泳，电泳结束后取下凝胶，将凝胶中的蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温下孵育1 h，10%TBST 洗涤3 次，每次 10 min，分别加入稀释后的一抗［TGF-β1（1 ∶500）、p38MAPK（1 ∶1 000）、p-p38MAPK（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶10 000）］，4 ℃下孵育过夜，用 10%TBST 洗涤 3 次，每次 15 min，加入相应二抗［HRP 标记的山羊抗兔（1 ∶2 000）和 HRP 标记的山羊抗小鼠（1 ∶2 000）］，室温下孵育 2 h，TBST 洗涤 5 次，每次约 12 min，取出 PVDF 膜，将显影液均匀地涂抹于膜上，曝光定影。然后通过Image J 软件检测灰度值，用于蛋白表达半定量分析。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，并进行方差齐性检验，方差相齐时采用LSD法，方差不齐时采用 Dunnett’s T3 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 图1显示，与空白组比较，模型组大鼠出现多饮、多尿、体质量减轻、毛发干枯脱落、行动迟缓、精神萎靡等症状，其中体质量更显著（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组大鼠体质量显著升高（P＜0.05）。与空白组比较，模型组大鼠左肾与体质量比例显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组其比例显著下降（P＜0.01）。

3.2 生化指标 图2显示，与空白组比较，模型组 BUN、Scr、CysC、HCY、IS、24 h 尿蛋白、IL-6、TGF-β1显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组上述指标显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠一般情况Fig.1 General conditions of rats in various groups

3.3 肾脏病理变化 图3显示，空白组大鼠肾脏形似蚕豆，色泽暗红，光镜下未见硬化肾小球；模型组大鼠肾脏体积增大，呈灰白色，表面粗糙，密布白色颗粒物，腺嘌呤代谢物结晶沉积于肾脏，大量炎症细胞浸润，肾小球结构紊乱，肾间质纤维化，肾小管囊性扩张，大量管腔闭塞，系膜增生明显，符合腺嘌呤模型肾脏病理变化；通腑泄浊法组、大黄配方颗粒组大鼠肾脏病理变化较模型组明显减轻。Masson 染色显示，与空白组比较，模型组大鼠肾脏纤维化程度显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组大鼠肾脏纤维化程度显著下降（P＜0.05）。

3.4 α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达 图4显示，与空白组比较，模型组大鼠α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组α-SMA 蛋白表达显著降低（P＜0.01），Col-Ⅰ蛋白表达也有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠生化指标Fig.2 Biochemical indices of rats in various groups

图3 各组大鼠肾脏病理变化Fig.3 Renal pathological changes of rats in various groups

3.5 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋 白 表达 图5显示，与空白组比较，模型组 TGF-β1、pp38MAPK 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，通腑泄浊法组两者蛋白表达显著降低（P＜0.01）。

4 讨论

慢性肾脏病临床表现与中医 “癃闭”“水肿”“肾劳”“溺毒”等病证相似，其病性为本虚标实，病机为脾肾亏虚，浊毒内蕴，素体禀赋不足、情志内伤、劳倦虚损等各种病因导致脾肾亏虚、湿浊蕴结、升降失司、浊毒内蕴而发病，内生浊毒之邪进而损伤肾元，累及肾络，致使气血运行不畅，瘀血内阻，肾失蒸腾气化，开阖无度，浊毒排泄失司，蓄积体内，进一步加重肾脏损害，六腑以通为用，故施以通腑泄浊之法，使内蕴之浊毒从大肠排出体外，为防止浊毒再次蓄积，通腑泄浊法应结合辨证贯穿于整个治疗。大黄作为通腑泄浊法的代表药物，常用于治疗慢性肾脏病，通腑泄浊方中该药材通腑泄浊，活血化瘀，可使内蕴之浊毒排出体外，为君药；生牡蛎收敛固涩，防大黄泻下太过；熟附子益肾温阳，扶助正气，并防止苦寒泻下之药攻伐太过；蒲公英清热解毒，散结消肿；生槐米凉血止血；六月雪清热利湿、舒筋活络，诸药配伍，共奏通腑泄浊、淡渗利湿、活血化瘀、温肾益气之功效。前期研究显示，泄浊方可降低腺嘌呤诱导的慢性肾脏病大鼠尿毒症毒素水平，延缓肾脏间质纤维化进展［1］。

图4 各组α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达Fig.4 α-SMA and Col-Ⅰ protein expressions in various groups

图5 各组 TGF-β1、p-p38MAPK 蛋白表达Fig.5 TGF-β1 and p-p38MAPK protein expressions in various groups

研究表明，TGF-β1／p38MAPK 信号通路与肾脏炎症及纤维化密切相关［2-3］，其中 p38MAPK 可通过调节 TGF-β1、核因子-κB（NF-κB）等表达来影响肾间质纤维化进展，是肾纤维化的一条经典途径［4］，是 MAPK 家族中的细胞内信号转导通路，激活后磷酸化的p38MAPK（p-p38MAPK）参与应激条件下细胞凋亡、免疫调节、细胞转化和炎性反应［5］；TGF-β1 通过激活成纤维细胞，使细胞外基质（ECM）合成增加并抑制其分解，可诱导肾小管上皮细胞纤维化［6-7］，作为 p38MAPK 通路上游的启动信号或下游的信号产物，它是信号转导的关键，在通路上游通过激活p38MAPK 发挥其生物活性，而作为下游p38MAPK 信号通路的产物，TGF-β1 合成过多时可加剧肾小球硬化和肾间质纤维化，加速慢性肾脏病进展［8］，而 p38MAPK 活化又可加重 TGF-β1 介导的小鼠小球系膜细胞肾损伤［9］，诱导肾脏细胞凋亡［10］。前期报道，大黄酸可有效抑制TGF-β1 所致间质成纤维细胞增殖，并抑制其诱导的间质成纤维细胞表达α-SMA 和纤维连接蛋白（FN）合成［11］，同时还可通过干扰 p38MAPK 信号通路来抑制大鼠肾小管上皮细胞转分化［12］。

本实验发现，腺嘌呤所致肾脏纤维化与TGF-β1／p38MAPK 信号通路过度激活相关，而通腑泄浊方与大黄可抑制慢性肾脏病大鼠肾脏TGF-β1、p-p38MAPK 过度表达，延缓肾脏纤维化进展，可能是通过抑制 TGF-β1／p38MAPK 信号通路所致；通腑泄浊法组、大黄配方颗粒组大鼠肾脏α-SMA表达较模型组明显降低，而Col-I 虽也有所下降但无明显差异，表明该方法延缓肾脏纤维化的作用点可能与抑制早期肾脏纤维化相关，同时若胶原蛋白在肾脏大量沉积时，单纯运用通腑泄浊法可能收效甚微，此时应结合患者病情予以补肾益气、活血化瘀等法；通腑泄浊方、大黄均可降低血清IS，前者作用显著更强，同时肠源性尿毒症毒素IS 也参与诱导肾脏纤维化［13］，通腑泄浊法组肾脏纤维化程度低于大黄配方颗粒组也可能也与此相关，而且单味大黄治疗可改善大鼠体质量，降低 BUN、CysC、24 h 尿蛋白，但对于降低单肾与体质量比例、Scr、HCY 仍显不足，可能与样本量偏小有关，也提示单味大黄虽然对慢性肾脏病具有疗效，但仍有局限，而进行相应组方配伍后各项指标改善均较明确，其机制可能与组方后所具有的多途径、多靶点治疗作用相关，同时也提示临床上单味药治疗病症时需根据实际情况加以辨治，切勿让中医药治疗囿于机械。

通腑泄浊法治疗慢性肾脏病的潜在机制并非单纯泻下排毒之功，仍宗去邪以安正之理，该方法不仅局限于祛邪排毒之效，更重要的在于其扶正护肾之力，潜在机制可能与以下几点有关：（1）调节肠道菌群，参与肠源性毒素的代谢，降低患者血清中毒素含有量；（2）调节与免疫相关的炎症因子IL-6、TGF-β1，从而减轻炎症反应、肾脏损害，并改善微炎症状态；（3）抑制促纤维化因子、肾脏纤维化相关信号通路及蛋白表达，从而延缓肾脏纤维化；（4）降低尿蛋白排泄，减轻尿蛋白对肾小管的损伤，抑制补体激活及细胞凋亡，保护足细胞，从而保护肾脏。

综上所述，通腑泄浊法可清除慢性肾脏病大鼠尿毒症毒素，降低24 h 尿蛋白，减轻相关炎症反应，并延缓肾脏纤维化进展，其机制可能与抑制TGF-β1／p38MAPK 信号通路有关。