羊蹄甲和穿山甲炮制品比较鉴别

沈多荣, 王慧芳, 吴芝园, 沈 敏, 谈如蓝, 刘 逊*

(1.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215009；2.苏州卫生职业技术学院，江苏 苏州 215009)

穿山甲，又名山甲片、甲片，为鲮鲤科动物穿山甲(Manis pentadactyla)的鳞甲，为国家二级重点保护野生动物，具有通经下乳，消肿排脓，搜风通络等功效。穿山甲鳞片由特殊的高酪氨酸β-角蛋白(KAP)构成，含有胆固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺以及蛋白、D-丝-L-酪环二肽、L-丝-L-酪环二肽等主要成分。课题组前期研究发现穿山甲经砂炒炮制后，脂溶性成分无显著变化、而蛋白成分显著减少，环二肽显著增加[1]。而且穿山甲炮制品的标志性成分D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽的含量变化与炮制条件存在相关性[2-3]。

羊蹄甲，为羊的蹄甲壳，民间有羊蹄甲代穿山甲的用药习惯[4]，市场上也有使用羊蹄甲炮制品冒充穿山甲的现象。目前有关于中药材鉴别的常见方法有通过性状，氨基酸组成分析，凝胶电泳分析、薄层层析等[5-7]。但羊蹄甲的鉴定研究过去主要集中于原药材，对于羊蹄甲炮制品的鉴别则未见报道，为了探讨羊蹄甲与穿山甲炮制品在形态与成分方面的异同，本研究拟通过性状、TLC、HPLC鉴定研究羊蹄甲与穿山甲炮制品在性状与成分的异同，建立鉴定羊蹄甲与穿山甲炮制品的方法，以去伪存真。

1 材料与方法

1.1 供试材料

D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽对照品为课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR等方法确证其结构，HPLC法检测纯度>99%；甲醇，磷酸，三乙胺(色谱纯，Fisher公司)。

TLC Scanner4 System薄层系统(瑞士CAMAG公司)；DGLC-3600 UltiMate® 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；本实验所用材料来源于苏州卫生职业技术学院馆藏标本。样品均由作者通过性状结合Cytb序列鉴定[8]。

1.2 实验方法

1.2.1 样品加工 羊蹄甲和穿山甲的炮制品为药材经砂烫加工而成，具体操作方法：分别取羊蹄甲和穿山甲，按照2015版药典附录Ⅱ D的烫法进行炮制，用砂烫至羊蹄甲和穿山甲全体膨胀呈卷曲状，呈黄色，质酥脆，临用前捣碎成粉末。

1.2.2 性状鉴定方法 从整体及粉末的大小、形态、色泽等方面[9]，对羊蹄甲及穿山甲炮制品进行性状鉴定。

1.2.3 TLC鉴别方法 取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品，粉碎成粗粉(过60目)。按药典穿山甲鉴别项下规定分别取羊蹄甲和穿山甲炮制品粗粉1 g置于不同烧瓶中，各加50 mL的二氯甲烷，加热回流提取1 h，放冷后过滤，取滤液进行蒸干，残渣加1 mL二氯甲烷复溶，即得供试品溶液。用毛细管分别吸取羊蹄甲炮制品溶液和穿山甲炮制品溶液10 μL，点于同一硅胶G薄层板上。分别采用3种展开系统进行展开，取出后晾干，喷适量的10%硫酸乙醇溶液显色，在105 ℃加热数分钟，置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.4 HPLC检测方法

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，流速：0.5 mL/min，流动相：甲醇-0.5%磷酸(15∶85)，检测波长：210 nm，进样量10 μL[10-11]。

1.2.4.2 供试品溶液 精密称取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的粉末(过6号筛)各1 g，分别置于不同的锥形瓶中，加15 mL水称重后，超声提取30 min。放冷至室温，称重后用水溶液补足减失的量并摇匀，进行过滤处理。取续滤液，用0.22 μm水系微孔滤膜滤过，即得到供试品溶液。在上述色谱条件下检测分析，得到羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的HPLC色谱图。

精密称取对照品D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽适量，用流动相溶解，配制得到质量浓度分别为 0.1 mg/mL的混合对照品溶液。在上述色谱条件下检测分析，得到对照品色谱图。

2 结果与分析

2.1 性状鉴定

羊蹄甲炮制品全体膨胀成鞋头状，外表面呈淡黄色至黄棕色，蹄壁厚薄不一，内中空呈船状，蹄底部有的呈三角形，质酥脆，易碎(图1)。穿山甲炮制品全体膨胀成扁片状或卷曲成不规则状，外表面呈淡黄色至黄棕色，宽端有数十条排列整齐的纵纹及数条横线纹，内表面中部有一条明显突起的弓形横向棱线(图1)。表明炮制品在外观性状方面存在显著差异，但两者粉末按药典穿山甲鉴别项下进行鉴别则无显著区别。

图1 羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制的外观性状图

2.2 TLC鉴别

羊蹄甲炮制品与穿山甲炮制品在TLC色谱相同的位置上，主要斑点分别显相同颜色荧光斑点，表明两者在TLC方面无法区别(图2)。

图2 TLC色谱图

2.3 HPLC检测

HPLC结果表明：羊蹄甲炮制品溶液中没有检测到穿山甲标志性成分D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽，而穿山甲炮制品具有这三种的标志性成分。表明HPLC可以区分羊蹄甲与穿山甲炮制品(图3)。

图3 HPLC色图谱

3 结论与讨论

穿山甲由于环境破坏及人为盗猎，其资源日渐濒危，价格也越来越高昂，不法分子为了谋求暴利，市场上存在着大量的以假乱真、掺假混淆等现象如用羊蹄甲炮制品冒用穿山甲，穿山甲、羊蹄甲炮制品两者整体性状存在差异，但是穿山甲临床调剂时需打碎入药，对于粉末状的穿山甲、羊蹄甲炮制品，药典穿山甲鉴别项下的粉末观察方法由于穿山甲粉末缺乏特征鉴别点，两者难以进行真伪识别。

为了区分两者的粉末，本研究用苯-丙酮(20∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(19∶1)、正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)3种TLC展开系统对穿山甲和羊蹄甲进行鉴别。由于羊蹄甲、穿山甲均来源于哺乳动物的角蛋白，两者脂溶性成分相近，导致薄层色谱中的主要斑点颜色及Rf值相近，说明药典项下的穿山甲薄层鉴别方法缺乏专属性，无法对羊蹄甲类药材做出鉴别。

而穿山甲与羊蹄甲炮制品水提液的HPLC图谱有显著差异，本法分辨力强，重现性好，可以快速、有效地鉴定穿山甲与羊蹄甲炮制品的药材与粉末，这可能是由于穿山甲中酪氨酸含量较高，炮制后产生的小肽以酪氨酸环二肽同系物为主；这保证了穿山甲炮制品的质量，可为也保障人民群众用药安全提供有效依据。