石豆兰无菌材料的建立及离体培养初探

黄崇成， 苗永美， 方 达， 王宇豪， 童 元

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

石豆兰属(Bublophyllum) 植物全世界约有1 000种，主要分布于亚洲、非洲和美洲热带地区。我国有98种3变种，主要产于长江流域及其以南各省区，尤以云南南部为多。该属植物具根状茎和假鳞茎，假鳞茎密生或疏生于根状茎上，卵圆至圆筒状，叶生于假鳞茎顶端。有些种的株型优美，花色幽雅、果实玲珑可爱，具有一定的观赏价值；有些具药用价值，常作民间用药的有15种，全草或假鳞茎皆可入药[1]，具清热、滋阴、消肿、抗癌、抗焦虑等功效[2,3]。兰科植物价值高，野生资源受到保护，怎样通过组织培养加快繁殖力度为人工栽培提供大量组培苗，或者通过细胞培养提取药用成分都是很重要的研究课题[3]。

植物生活在自然界中其表面会带有各样微生物，甚至其组织内也生有大量菌，尤其兰科植物特殊生境、生长缓慢、具药用功能等特点都会使得植物内外菌物较为丰富，这给无菌材料建立带来巨大困难。在开展石豆兰离体繁殖体系建立时发现石豆兰横走茎、假鳞茎表面菌较多，内生菌也极为丰富[4]。因此，本试验开展内外菌物消毒处理方法研究及探索激素浓度，建立起离体繁殖体系并获取大量无菌材料，为下一步原球茎诱导、增殖、悬浮培养、诱变等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用石豆兰(Bulbophyllumsp.)材料采自福建南屏鸳鸯猕猴自然保护区。制霉菌素和萘啶酮酸用乙醚灭菌处理，纱布封口，挥干后，加入无菌水配成50 mg/mL的悬液。

1.2 方法

1.2.1 外植体外生菌的处理 取横走茎最前端新生出的小嫩芽和假鳞茎两种外植体，清水冲洗表面，加入0.1% HgCl2后分成两组，一组做超声(40 kHz，下同)处理，另一组不做超声处理，处理5、10、15、20 min，共8个处理，无菌水漂洗5次，吸干。芽切除少许基部，假鳞茎约切成0.5 cm3的小块，接种到M1：MS+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培养基上，每处理接种10瓶，每瓶3个芽和3个切块。7 d统计污染和成活情况，污染率=污染外植体数/总外植体数×100%，成活率=成活外植体数/总外植体数×100%。

1.2.2 外植体内生菌的处理 1.2.1试验结果表明假鳞茎在M1培养基上死亡率高，难以再分化出器官。因此，后面试验只选用小嫩芽做培养材料，表面消毒处理后接种于添加制菌霉素和萘啶酮酸的M1培养基中，添加浓度见表2。每处理10瓶，每瓶6个材料，每个月转接1次，培养90 d后计算污染率和成活率。

1.2.3 不同激素配比对外植体的生长的影响 取未污染的小嫩芽接种于M1培养基上，此时逐渐降低培养基中抗菌素浓度，经过长时间多次继代后，基部逐渐长出粗壮的根，嫩芽生长，基部变粗形成椭圆形即假鳞茎，上面着生二叶，根茎处分化出小芽。为了探讨激素配比对芽分化的影响，根据前期实验，选用6-BA和NAA两种激素，采用正交设计，具体表3。将单鳞芽带根切下选取大小差不多一致的带根鳞芽作为接种单元，每处理5瓶，每瓶4个鳞茎，60 d后统计新长出的芽，按培养后芽数/接种时芽数计算增殖倍数。

以上培养基中需添加0.5 g/L 活性炭、100 g/L土豆汁、3 0 g/L蔗糖、6 g/L琼脂粉，pH=6.5。光照时间为12 h/d，光照强度为40 μmol /(m2·s)，温度25±2 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式的消毒效果比较

表1 不同处理方式对外植体的杀菌效果

由表1可知，假鳞茎的污染率高，说明假鳞茎内外菌较多，而成活率比芽低，大部分逐渐发黄发白死亡，未死亡的只是维持绿色未见分化说明假鳞茎分化要求较高。单独使用HgCl2消毒时，2种外植体的污染率都随处理时间的延长逐渐降低，而成活率先升高后降低，有一些材料虽未出现污染，但长时间的HgCl2处理会对2种外植体造成伤害从而导致成活率下降；当然也有些材料出现轻微的污染但仍然存活。根据污染率和成活率综合来看，在单独使用HgCl2时，处理时间10 min效果最好。

HgCl2结合超声处理比单独使用HgCl2会降低污染率，芽污染率降低幅度在10%～20%之间，假鳞茎污染率降低幅度在13.33%～26.67%之间；只有超声5～10 min处理能提高2种外植体的成活率，长时间超声会降低成活率，可能因长时间超声处理会对植物造成伤害。由此看出，HgCl2结合超声处理能降低污染率，提高成活率，处理10 min时效果最好，芽和假鳞茎的污染率都降低了20%，成活率分别提高了10%和3.33%。

2.2 不同抗生素组合对石豆兰内生菌的抑制效果比较

表2 不同抗生素组合对内生菌的抑制效果比较

药用植物往往含内生菌，采取HgCl2结合超声处理对表面菌起到较好的杀伤作用，而对内部菌杀伤力较弱，本研究发现随着长时间继代培养，材料切口处逐步长出多种菌物，生长缓慢，符合内生菌的生长特征，建立无菌材料时针对内生菌采取的做法是加入抗生素。由表2可知，仅采取HgCl2结合超声处理在短时间内呈现较低的污染率，90 d后内生菌逐渐长出，污染率达83.33%；当培养基中加入制菌霉素和萘啶酮酸后，污染率降低。根据污染率和成活率两个指标综合考虑，确定最佳抗菌素组合为7号处理即制菌霉素75 mg/L和萘啶酮酸50 mg/L抑制效果最好，90 d时污染率为20.00%，无菌材料成活率为60%，芽出现了萌发和明显的生长。

2.3 不同激素浓度和配比对鳞芽增殖的影响

表3 不同激素浓度和配比对鳞芽增殖的影响

表4 增殖培养中因素多重比较

注：同列数值间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著。

图1 石豆兰增殖

从图1看出，芽主要从鳞芽基部长出并逐步生长，有些从鳞芽顶部分化出，分化情况受激素调控。多重比较结果(表4)说明6-BA和NAA对于石豆兰鳞芽的增殖影响显著，增殖倍数随着6-BA浓度升高先增大后降低，2水平即0.4 mg/L时最大，显著高于其它两个水平；随NAA浓度的增加，增殖倍数逐渐增大，3水平即0.2 mg/L时最大并显著高于1和2水平，但是1和2水平之间差异不显著。根据多重比较得出石豆兰离体繁殖的最佳的激素配比为6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L，此激素配比即6号培养基上鳞芽经过60 d的增殖培养，增殖了2.90倍。

3 结论与讨论

本研究所用的石豆兰属植物其外植体消毒非常困难，因为在自然条件下外植体外部和内部都带有较多的细菌，霉菌，尤其是兰科植物，常年生活在空气湿度大的环境中，加上生长周期较长的特点，外植体内外菌物非常丰富，给离体培养建立无菌材料时带来巨大困难。

建立无菌起始材料时主要考虑的因素有外植体类型和消毒方法。选取外植体时要考虑材料来源、细胞全能性和消毒难易程度等，通过前期预实验[4]，表明兰科植物叶片再生能力非常弱，培养中逐渐黄化死亡；横走茎已木质化，细胞全能性较低，也不适合选用[5-7]。本研究选取嫩芽和假鳞茎为外植体，发现假鳞茎内生菌多，尤其是生长周期更长的假鳞茎其内生菌更为丰富，经过切割后内生菌容易长出；此外鳞茎切块易黄化，仅少数维持绿色但没有分化，只有接入新形成的小球茎在未污染的情况下出现了生长。基于上述原因，通过假鳞茎难以建立无菌材料，本研究采用横走茎前端新长出的嫩芽为外植体建立无菌材料。

植物外植体常采用化学方法消毒，主要考虑消毒剂的种类、浓度、时间，三个因素具有很强的相关性，使用力度越大，杀菌越彻底；若把握不好力度，外植体也会受到药剂伤害死亡。怎样在保证杀死菌物的同时不能对外植体造成伤害，保证较高的成活率，是建立无菌材料时考虑的重要因素。化学药剂常采用的是HgCl2和NaClO。NaClO因具漂白作用，不适合绿体材料；HgCl2因效果好常被选用[8]。有研究报道超声波辅助化学法能降低组培苗的污染率、提高成活率，大大降低HgCl2浓度和处理时间[9]。本研究表明HgCl2结合超声比单独使用HgCl2效果好，获得较低的污染率和最高的成活率。内生菌丰富的外植体仅采用一般的化学、物理表面消毒法难以杀死内部微生物，一般采取消毒液中[10]或培养基中添加杀菌剂来抑制内生菌[11]，用到的杀菌剂有多菌灵、链霉素、庆大霉素、头孢噻肟、青霉素等[12]。基于每种抗生物的杀菌谱限制，常采用多种抗生物联合使用，还需考虑使用浓度和时间。前期预实验发现石豆兰内部含细菌和真菌，因此选用制菌霉素和萘啶酮酸两种，经过浓度筛选确定75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸组合最好，90 d时统计污染率仅为20%，成活率为60%。

激素是植物器官分化的重要调控因子。本研究选用了6-BA和NAA 2种激素，两种激素配比下，石豆兰鳞茎切块难以分化出原球茎或芽。本研究以带根的整个假鳞茎为培养单元，芽主要从鳞茎的根基部分化出，也有少量芽从叶片中间或鳞茎表面分化出来。芽的分化会显著受激素调控影响，6-BA 0.40 mg/L 和NAA 0.2 mg/L配比下，芽的增殖效果最好，为2.90倍。研究中发现石豆兰植物分化容易，但生长缓慢，增殖周期较长，与近缘属植物石斛的增殖类似[13-14]。关于石豆兰属植物的组织培养报道非常少，不同种植物所需的激素不同，李洪林等[6]在进行广东石豆兰组培时，增殖培养所用激素配比6-BA 2.5 mg/L和NAA 0.05 mg/L，增殖系数达4～5倍。

综上所述，0.1%HgCl2结合超声处理10 min较有效地杀死石豆兰外植体表面微生物，培养基中添加75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸能有效抑制石豆兰内生菌，建立了以鳞芽为起始材料的无菌材料。鳞芽在6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L激素配比条件下增殖效果最好。