5种中草药对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

曾本和，王万良，周建设，张忭忭，王金林， 刘海平，牟振波

(1.西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，西藏 拉萨 850032；2.西藏自治区农牧科学院，西藏 拉萨 850000)

异齿裂腹鱼(SchizothoraxoconnoriLloyd)隶属鲤科(Cyprindiae)裂腹鱼亚科(Schizothracinae)裂腹鱼属(Schizothorax)，别名棒棒鱼，分布于雅鲁藏布江上、中游的干支流及附属水体，占雅鲁藏布江渔获物的35%～42%[1]，为产区主要经济鱼类之一[2-4].雅鲁藏布江属于高原河流，饵料较少，生态脆弱；同时水温低，鱼生长慢，性成熟周期长.如果鱼类生态被破坏，将极难恢复.目前雅鲁藏布江水域生态正遭受严峻的考验，首先，雅鲁藏布江上的水电站建成将导致水域环境改变，生境片段化，极大威胁到土著鱼类.其次，随着经济、旅游业的发展和内地人口的迁入，近年来对西藏鱼类需求越来越大，出现了过度捕捞的现象，同时生活污水的排入，极大影响了西藏土著鱼类资源量.再者，近年来雅鲁藏布江外来物种入侵严重，导致西藏本土鱼生存空间大大减少，土著鱼类资源量严重缩减.20世纪70年代末，雅鲁藏布江的裂腹鱼类体质量为500～1 000 g/尾，2010年渔获物体质量为200～709 g/尾[1]，这说明雅鲁藏布江裂腹鱼资源量正在小型化.虽然异齿裂腹鱼人工繁殖成功，但规模化繁育的瓶颈尚未攻坡.人工繁育过程中水霉严重，导致鱼卵孵化率极低，造成大量经济损失.

水霉病是淡水鱼繁育过程中的常见病害之一，其病原是水霉(Saprolegnia)，隶属于茸鞭生物界(Stramenopila)水霉目(Saprolegniales)水霉科(Sprolegniaceae)[5].孔雀石绿是治疗水霉病的有效药物，但由于该药具有高毒性，高残留等问题[8-9]，2002年被农业部列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》.生产上虽然也使用过氧化氢、臭氧、氯化钠、福尔马林、腐植酸等化学药物，但是这些药物缺乏高效性，并且安全风险较高而未得到广泛认可[10-12].中草药具有安全、有效、毒副作用小、无二次污染、不易产生耐药性等特点.有关中草药防治水产动物水霉病已有先例报道[13-14].

本试验以异齿裂腹鱼鱼卵为研究对象，选择5种中药设置梯度试验，从异齿裂腹鱼鱼卵到孵化出膜，每天用不同浓度的5种中药浸泡，计算孵化率、畸形率、死卵率、水霉致死率和其他因素致死率，探讨5种中草药预防水霉传染效果，为异齿裂腹鱼水霉病防治提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 鱼卵及孵化条件

异齿裂腹鱼鱼卵取自2017年4月在西藏自治区拉萨市曲水县西藏土著鱼类增殖育种场繁殖的同一批鱼卵5.4万粒(2条鱼的混合鱼卵)，平均受精率87%，为非粘性卵.将鱼卵平均分为27组，每组2个平行，每个平行1 000粒卵.将鱼卵放入孵化框放在4.3 m×2.7 m×0.5 m的水泥池中孵化.孵化用水为井水，井水在蓄水池中充分曝气，曝气后井水溶氧为8.5～9.9 mg/L；孵化水泥池微流水，水体每30 min交换1次，使孵化水体溶氧保持在6 mg/L以上；孵化期间井水水温保持恒定，为(13.3±0.2)℃.

1.2 中药的制备

5种中草药购自于重庆长圣医药公司中药部.分别称取5种中药，加10倍量的水浸泡1 h，文火煎煮1 h，60目纱布过滤，滤液保存；药渣加10倍重量水，进行第2次文火煎煮45 min，60目纱布过滤，滤液保存.药渣再加10倍重量水，进行第3次文火煎煮30 min，60目纱布过滤，滤液保存.将3次滤液合并，得到5种中药的提取物.

1.3 试验设计

5种中药均设置5个浓度梯度，同时设置1个阴性对照(空白对照，没有任何药物浸泡)和1个阳性对照(质量浓度为4 mg/L孔雀石绿)，分组设置如表1所示.将药液换算为中药重量，按照表格中的比例在孵化盆中配备，将孵化框转移到孵化盆中浸泡35 min[15]，浸泡过程中曝气增氧，使水体溶氧含量保持在6 mg/L以上，浸泡结束再将孵化框转移到孵化池中.

表1 试验分组

1.4 指标测定

从鱼卵形成至出膜期间，每天浸泡1次(9∶30～10∶05).每日药浴前进行活卵、水霉致死死卵(解剖镜镜检，卵膜有水霉穿透)及其他因素致死(解剖镜镜检，卵膜及胚胎没有发现水霉)计数.试验结束后，对每组出膜鱼苗及畸形鱼苗(身体畸形)进行计数，孵化鱼卵总数为试验开始时投放鱼卵数.

孵化率(%)=孵化鱼苗数/孵化鱼卵总数×100%

死卵率(%)=死卵数/孵化鱼卵总数×100%

水霉致死率(%)=水霉致死卵数/孵化鱼卵总数×100%

其他因素致死率(%)=其他因素致死卵数/孵化鱼卵总数×100%

畸形率(%)=畸形鱼苗数/出膜鱼苗数×100%

1.5 数据处理

试验结果用“平均值±标准差”表示.试验数据采用采用SPSS 19.0统计软件中One-way ANOVA进行方差分析，若组间差异显著，再用Duncan氏进行多重比较，差异显著水平为α=0.05.

2 结果与分析

2.1 五倍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉的防治效果

对照组对异齿裂腹鱼鱼卵的作用见图1.五倍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果见图2.五倍子浸泡组鱼卵孵化率及鱼苗畸形率(表2)均显著高于阴性对照组，低于阳性对照组(P<0.05)；水霉致死率均显著低于阴性对照组，高于阳性对照组(P<0.05).不同浓度五倍子浸泡组中，1.5 g/L五倍子组水霉致死率最低，与2.4 g/L五倍子组效果差异不显著(P>0.05)，显著低于0.7、1.1和1.9 g/L五倍子组(P<0.05).0.7 g/L五倍子组孵化率最高，与1.1、2.4 g/L五倍子组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他试验组(P<0.05).0.7 g/L五倍子组鱼苗畸形率最低，与1.1 g/L五倍子组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他试验组(P<0.05).综合考虑异齿裂腹鱼鱼卵水霉致死率、孵化率及鱼苗畸形率，五倍子适宜浸泡浓度为0.7、1.1、1.5 g/L.

表2 各试验组死卵率、孵化率及畸形率统计表

同列相同小写字母或没有字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

The same letter or no letter in the same column indicate no significant difference(P>0.05)，the different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 大黄对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

大黄对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果如图3所示.大黄浸泡组鱼卵孵化率及鱼苗畸形率均显著高于阴性对照组(表2)，低于阳性对照组(P<0.05)；水霉致死率均显著低于阴性对照组，高于阳性对照组(P<0.05).不同浓度大黄浸泡组中，0.4 g/L大黄组水霉致死率最低，与0.7 g/L大黄组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他试验组(P<0.05).0.4 g/L大黄组孵化率最高，与0.1 g/L大黄组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他试验组(P<0.05).0.1 g/L大黄组鱼苗畸形率最低，显著低于其他试验组(P<0.05)；其次为0.4 g/L大黄组，显著高于0.1 g/L大黄组(P<0.05)，显著低于其他试验组(P<0.05).综合考虑异齿裂腹鱼鱼卵水霉致死率、孵化率及鱼苗畸形率，大黄适宜浸泡浓度为0.1、0.4 g/L.

图1 阴性和阳性对照组异齿裂腹鱼鱼卵情况Figure 1 The situation ofSchizothorax oconnorifertilized eggs between negative and positive control groups

图2 五倍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果Figure 2 The prevention and treatment effects ofRhus Chinensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

图3 大黄对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果Figure 3 The prevention and treatment effects of Chinese rhubarb onSaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.3 山苍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

山苍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果如图4所示.山苍子浸泡组鱼苗畸形率均显著高于阴性对照组(表2)，低于阳性对照组(P<0.05)；水霉致死率均显著低于阴性对照组，高于阳性对照组(P<0.05)；鱼卵孵化率部分高于阳性对照组.不同浓度山苍子浸泡组中，0.6 g/L山苍子组水霉致死率最低，与1.1、1.6、2.1 g/L山苍子组差异不显著(P>0.05)，显著低于0.1 g/L山苍子组(P<0.05).0.6 g/L山苍子组孵化率最高，与1.1、1.6 g/L山苍子组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他试验组(P<0.05).0.6 g/L山苍子组鱼苗畸形率最低，显著低于其他试验组(P<0.05).综合考虑异齿裂腹鱼鱼卵水霉致死率、孵化率及鱼苗畸形率，山苍子适宜浸泡浓度为0.6 g/L.

图4 山苍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果Figure 4 The prevention and treatment effects ofLitsea cubebaon fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.4 黄芩对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

黄芩对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果如图5所示.黄芩浸泡组鱼卵孵化率及鱼苗畸形率均显著高于阴性对照组(表2)(P<0.05)；水霉致死率均显著低于阴性对照组，高于阳性对照组(P<0.05).不同浓度黄芩浸泡组中，1.5 g/L黄芩组水霉致死率最低，显著低于其他试验组(P<0.05).1.2 g/L黄芩组孵化率最高，显著高于其他试验组(P<0.05).0.6 g/L黄芩组鱼苗畸形率最低，显著低于其他试验组(P<0.05).综合考虑异齿裂腹鱼鱼卵水霉致死率、孵化率及鱼苗畸形率，黄芩适宜浸泡浓度为0.6、0.9、1.2、1.5 g/L.

2.5 苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果如图6所示.苦参浸泡组鱼苗畸形率及鱼卵孵化率均显著高于阴性对照组(表2)(P<0.05)；水霉致死率均显著低于阴性对照组，高于阳性对照组(P<0.05).不同浓度苦参浸泡组中，1.2 g/L苦参组水霉致死率最低，显著低于其他试验组.1.5 g/L苦参组孵化率最高，但各试验组差异不显著(P>0.05).0.9 g/L苦参组鱼苗畸形率最低，显著低于其他试验组(P<0.05).综合考虑异齿裂腹鱼鱼卵水霉致死率、孵化率及鱼苗畸形率，苦参适宜浸泡浓度为0.9、1.2、1.5 g/L.

图5 黄芩对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果Figure 5 The prevention and treatment effects ofScutellaria baicalensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

图6 苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果Figure 6 The prevention and treatment effects ofSophora flavescenson fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

3 讨论

3.1 五倍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

五倍子有效成分包含鞣质、没食子酸、槲皮素、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄素和1,8-二羟基蒽醌等[16]，抑制真菌生长[17].对多鳞铲颌鱼(Varicorhinusmacrolepis)水霉病的药物筛选及其药效研究发现五倍子无论是单独用药还是联合用药，都有较好的抗水霉菌效果[18].0.64 mg/mL的五倍子水提取物可有效抑制水霉孢子萌发[13]，对致病水霉菌的抑菌率可达37.92%[19].在本试验中，五倍子试验组鱼卵孵化率较阴性对照组提高了17.22%～25.12%，水霉感染致死率较阴性对照组降低了26.11%～31.35%，并且五倍子对鱼卵影响小，鱼苗畸形率与阴性对照组差异不显著，因此五倍子在未来的抗水霉药物研发中有较大的应用潜力，可用于水霉病的防控及治疗.

3.2 大黄对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

大黄有效成分提取物中含大黄素、大黄酸、大黄酚等物质[20]，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生长等药理作用[21].研究发现大黄对山女鳟(Oncorhynchusmasou)水霉病病原具有较好的抑制及杀灭效果.马江耀[19]研究发现大黄对致病水霉菌的抑菌率可达40.76%.在本试验中大黄实验组鱼卵水霉致死率均显著低于阴性对照组，0.1、0.4 g/L大黄组鱼卵孵化率显著高于阴性对照组.因此，大黄可作为异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治参考药物.

3.3 山苍子对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

山苍子果实可提炼出山苍子精油，其柠檬醛含量约为60%～80%，山苍子精油具有很好的抗氧化和抗菌性能，已被国内外较多学者证实[22].沈琦[23]在对罗非鱼(Oreochromisspp)和鳗鲡(AnguillajaponicaTemminck et Schlegel)研究时发现山苍子具有较好抑杀水霉能力.马江耀[19]研究发现山苍子对致病水霉菌的抑菌率可达46.75%.在本试验中，山苍子试验组鱼卵孵化率较阴性对照组提高了24.20%～34.58%，水霉感染致死率较阴性对照组降低了27.92%～31.42%.因此山仓子可作为防治鱼卵水霉的特效中药.

3.4 黄芩对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

黄芩有效成分提取物中含黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生长等作用[20].蔺凌云等[13]研究发现0.64 mg/mL的黄芩水提取物可有效抑制水霉孢子萌发.甄珍[24]研究表明黄芩对山女鳟水霉病病原具有较好的抑制及杀灭效果.在本试验中，黄芩试验组鱼卵孵化率较阴性对照组提高了19.24%～32.40%，水霉感染致死率较阴性对照组降低了29.55%～31.62%.因此黄芩可作为防治鱼卵水霉的特效中药.

3.5 苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果

苦参有效成分提取物中含有苦楝素物质具有抑制真菌生长的作用[21,25].刘荣军[26]、沈琦等[23]研究均发现苦参对水霉病病原具有较好的抑制及杀灭效果.在本试验中，黄芩组鱼卵孵化率较阴性对照组提高了19.24%～31.44%，水霉感染致死率较阴性对照组降低了27.09%～32.07%.但甄珍[27]研究发现苦参对山女鳟水霉菌丝几乎无抑制作用.可能是因为煎煮方法导致药液中有效成分失活，或者是水霉品种不同，而苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉菌丝有抑制和杀灭作用，但对山女鳟水霉菌丝无效.

3.6 5种中草药对异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治效果比较

本试验研究发现,1.5 g/L五倍子组，0.4、0.7 g/L大黄组，0.6、1.1、1.6 g/L山苍子组，本试验所有浓度黄芩组，1.2、1.5、1.8 g/L苦参组鱼卵水霉致死率较低，与阳性对照组差异不显著(P>0.05).0.7 g/L五倍子组，0.1、0.4 g/L大黄组，本试验所有浓度山苍子组，1.2、1.5、1.8 g/L黄芩组，本试验所有浓度苦参组鱼卵孵化率均较高，与阳性对照组差异不显著(P>0.05).本试验所有浓度五倍子组，0.1、0.4、0.7 g/L大黄组，0.6 g/L山苍子组，0.6、0.9 g/L黄芩组，0.9、1.2 g/L苦参组鱼苗畸形率均较低.平均孵化率苦参组>山苍子组>黄芩组>五倍子组>大黄组；鱼苗畸形率五倍子组<大黄组<山苍子组<苦参组<黄芩组.中草药成分较为复杂，其部分组成成分对鱼卵具有危害，导致异齿裂腹鱼鱼卵孵化率及鱼苗畸形率存在差异，其具体原因有待进一步研究.因此，为了避免中草药部分成分对异齿裂腹鱼鱼卵及鱼苗造成损伤，下一步需要对中草药成分进行分离，探索可以防治其鱼卵水霉的有效成分以及对其鱼卵及鱼苗造成损伤的成分，从而推动异齿裂腹鱼鱼卵水霉防治特效药开发.

4 结论

五倍子、大黄、山苍子、黄芩、苦参对异齿裂腹鱼鱼卵水霉均具有很好的抑制和杀灭效果，最佳浸泡浓度为 0.7、1.1、1.5 g/L五倍了组，0.1、0.4 g/L大黄组，0.6 g/L山苍子组，0.6、0.9、1.2、1.5 g/L黄岑组，0.9、1.2、1.5 g/L苦参组.在孔雀石绿被禁用的现实情况下，这几种药可作为防治异齿裂腹鱼鱼卵水霉提供参考依据.