山西朔州甘草中重金属及有机氯农药残留含量测定

卢晓林,曲婷丽,许晋芳,赵正保

(山西医科大学药学院药物化学教研室,太原 030001;*通讯作者,E-mail:zhengbao-z@sxmu.edu.cn)

中药材是我国传统医学的重要组成,它不仅维护了我国人民的身体健康,还为世界医学的发展提供了重要支持。甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)又叫甜草、国老、甜根子等。豆科、甘草属,国内主要分布在新疆、内蒙古、宁夏、甘肃、山西朔州[1],春、秋二季采收,根及根茎入药。其性甘,味平,归心、肺、脾、胃经,中医上临床主要用于补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,消炎[2,3]止痛,还可调和诸药,使用广泛[4]。

但是,近年来,随着我国经济发展和人口增长,中药材的野外生长环境遭到了严重破坏和污染,由此引起药材中重金属含量增多和有机氯农药残留日益严重,生长范围广泛的甘草也不可避免。尽管人工种植可以弥补部分市场需求,可是培育药材与野生药材质量差异明显[5-7]。因此,测定甘草中的重金属含量以及有机氯农药残留量是非常必要的,不仅可以指导临床安全用药,还可以监测生长地的环境污染程度,指导人工培育合理使用农药[8]。本文采用灵敏度和精密度较好的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)来测定重金属含量[9-11],气相色谱法测定有机氯农药残留的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电感耦合等离子体质谱仪(Thermo,型号iCAPQ),高压消解罐,电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,AL104型),旋转蒸发仪(IKA HB10),注复式脱色摇床(TS.B-108),低速台式离心机(TDL-5-A),超声波清洗器(SB-5200DTDM),精密天平(TE612-L,ZA3052H),气相色谱仪(日本岛津公司,GC-2010),电热恒温鼓风干燥箱(上海一横科技有限公司,DHG-9070型),倾斜式高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司,FW-400A)。

1.2 试剂

石油醚(60-90 ℃)(色谱纯),丙酮(分析纯),二氯甲烷(色谱纯),浓硫酸(分析纯),无水甲醇(分析纯,以上试剂均购自天津市大茂化学试剂厂);无水硫酸钠(分析纯),氯化钠(分析纯,以上试剂均购自天津市风船化学试剂科技有限公司)。

铜(Cu)对照品溶液(GSB04-1725-2004),砷(As)对照品溶液(GSB04-1714-2004),镉(Cd)对照品溶液(GSB04-1721-2004),汞(Hg)对照品溶液(GSB04-1729-2004),铅(Pb)对照品溶液(GSB04-1742-2004),质量浓度均为1 000 μg/L;锗(Ge)、铟(In)、铋(Bi)混合内标储备液(GSB04-2826-2011),质量浓度均为10 μg/ml。以上对照品购自国家标准物质研究中心。硝酸(优级纯),去离子水。

有机氯对照品:六六六(BHC)为α-BHC(10 mg,批号:0911942),β-BHC(10 mg,批号:12354),γ-BHC(10 mg,批号:23077)和δ-BHC(10 mg,批号:081214KC);滴滴涕(DDT)为p,p′-DDE(10 mg,批号:25867),p,p′-DDD(250 mg,批号:26602),p,p′-DDT(10 mg,批号:041014MT)和o,p′-DDT(10 mg,批号:070912DT);五氯硝基苯(PCNB,10 mg,批号:09424KS)均购自Accustandard公司;纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司生产)。

1.3 药材样品

甘草采集于山西省朔州市不同地方(编号:S1-S10),由山西医科大学药学院中药学教研室白云娥副教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 重金属含量测定

2.1.1 ICP-MS工作条件 射频功率1.15 kW;采样深度65 mm;辅助气流速1.0 L/min;冷却气体流量13.0 L/min;环境温度25 ℃;自动等离子体观测。

2.1.2 测定方法 测定选取的同位素为63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb,其中63Cu、75As以72Ge作为内标,114Cd以115In作为内标,202Hg、208Pb以209Bi作为内标,并根据不同仪器的要求选用适宜校正方对测定的元素进行校正。

仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中,依次将仪器的样品管插入各个浓度的标准品溶液中进行测定(浓度依次递增),以测量值为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

2.1.3 溶液的制备 对照品贮备溶液的制备:分别精密量取Pb、As、Cd、Hg、Cu单元素标准溶液适量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分别含Pb、As、Cd、Hg、Cu的量为1.0 μg、0.5 μg、1.0 μg、1.0 μg、10 μg的贮备液,备用。

混合对照品溶液的制备:精密量取Pb、As、Cd、Cu对照品贮备液适量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分别含Pb、As 0,1,5,10,20 ng;含Cd 0,0.5,2.5,5,10 ng;含Cu 0,50,100,200,500 ng的系列浓度混合溶液。另精密量取Hg对照品贮备液适量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分别含Hg 0,0.2,0.5,1,2,5 ng的溶液,Hg对照品溶液应临用现配。

内标溶液的制备:精密量取Ge、In、Bi标准溶液适量,用5%硝酸溶液配制成每1 ml各含1 μg的混合溶液,备用。

供试品溶液的制备:将药材用自来水冲洗干净后,再用去离子水漂洗多次,自然晾干后置于烘箱中,60 ℃烘至恒重,取出后粉碎。取供试品约0.5 g,精密称定,置高压消解罐中,加硝酸5 ml,静置过夜,旋紧不锈钢外套,放入恒温干燥箱于150 ℃消解4 h,取出,放冷,缓慢旋松不锈钢外套,将消解液置于50 ml容量瓶中,用少量水洗涤消解罐,洗液合并于量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,待测。

空白对照溶液:往高压消解罐中加硝酸5 ml,静置过夜,旋紧不锈钢外套,放入恒温干燥箱于150 ℃消解4 h,取出,放冷,缓慢旋松不锈钢外套,将消解液置于50 ml容量瓶中,用少量水洗涤消解罐,洗液合并于量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,待测。

2.1.4 标准曲线的绘制 量取适量“2.1.3”项下方法配制的Pb、As、Cd、Cu系列浓度混合对照品溶液和系列浓度的汞对照品溶液,采用电感耦合等离子体质谱法,按照2.1.2项下方法测定,得Pb、As、Cd、Hg、Cu 5种重金属元素的线性方程(见表1)。

表1 5种重金属元素的线性方程

Table 1 Linear equations of five heavy metal elements

元素线性方程 R2线性范围(ng/ml)Pby=62082.3194x+25418.04650.99880-20Asy=663.0321x+404.19730.99930-20Cdy=3569.0946x+100.00070.99880-10Hgy=297.3857x2+8776.0062x-56.25500.99850-5 Cuy=8673.7194x+968.37310.9998 0-500

2.1.5 精密度试验 取“2.1.3”项下混合对照品适量,按照“2.1.1”项下条件对每种重金属元素平行测定6次,Pb、As、Cd、Hg、Cu相应测定值的RSD依次为5.2%,7.7%,8.2%,6.3%,4.1%,精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密称取“2.1.3”项下供试品(S1)适量,分别于室温下放置6,12,24,48,15,30 d后按照“2.1.1”测定,Pb、As、Cd、Hg、Cu的响应值的RSD依次为4.7%,8.0%,7.3%,5.8%,3.5%,结果显示供试品溶液在室温下30 d内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 精密称取编号S1的平行甘草药材6份,按照“2.1.3”项下供试品溶液制备的方法消解处理样品后,制作成相应的供试品测定,所得各元素测定值的RSD为4.9%,7.8%,7.9%,5.6%,4.0%,重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 从甘草中取已知含量的编号S1的药材样品9份,精密称定,分别加入适量高、中、低质量的待测元素对照品溶液,按照按照“2.1.3”项下供试品溶液制备的方法处理、测定并计算加样回收率,结果见表2。从表中可以看出铜、砷、镉、汞、铅的回收率满足了痕量分析加样回收率的要求,加样回收率良好。

表2 重金属含量测定中甘草加样回收率试验

Table 2 Recovery test of licorice in heavy metal content determination

金属元素本底(μg/L)加标值(μg/L)测定值(μg/L)123回收率 (%) Cu143.27125.00166.256160.977-70.8-91.950.00180.228187.091184.12773.9-87.5100.00226.455239.488224.79381.5-96.2As3.2101.004.1874.1193.77290.9-97.72.005.4175.3445.248101.9-110.34.007.4548.1787.811106.1-124.2Cd0.3740.300.7430.7360.679101.5-122.90.601.0351.1081.078110.2-122.31.001.5321.6171.564115.8-124.9Hg0.3080.300.6640.6280.59294.6-118.60.600.9250.9791.008102.9-116.71.001.3291.3371.340102.1-103.2Pb3.6921.004.4684.542-77.6-85 2.005.0515.4705.54568.0-92.74.006.8157.0587.04878.1-84.2

“-”表示误差太大,已删除

2.1.9 甘草中5种重金属元素的含量测定 从10个编号的甘草药材中各取约0.5 g,精密称定,按照“2.1.3”项下供试品溶液制备的方法处理并进行测定,每批样品平行测定2次(结果见表3)。《中国药典》(2015版)中重金属元素限量规定:Pb≤5 mg/kg;Cd≤0.3 mg/kg;As≤2 mg/kg;Hg≤0.2 mg/kg;Cu≤20 mg/kg。从表3中可以看出,测定的甘草中5种重金属元素实际测得结果均低于限量规定,约为规定值的1/16-1/2,这可能与药材种类和当地生长环境等有关。

表3 甘草中5种重金属含量

Table 3 Content determination of five heavy metals in licorice

批号取样量(g)63Cu75As111Cd202Hg208Pb平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)S10.5025107.33510.6802.2290.2220.2740.0270.3380.0343.2650.325S20.5028107.28010.6682.2510.2240.2830.0280.3310.0332.9640.295S30.481195.1219.8861.9870.2070.2820.0290.2900.0303.2360.336S40.480294.2179.8102.0270.2110.2630.0270.2610.0272.9810.310S50.5023101.63310.1172.1560.2150.2850.0280.2800.0283.3040.329S60.5026105.19010.4652.1860.2170.2850.0280.2960.0293.2400.322S70.5024106.46510.5962.1880.2180.2740.0270.2830.0282.9600.295S80.5018102.87810.2511.9800.1970.2810.0280.2820.0282.9850.297S90.5016103.60910.3282.1580.2150.2800.0280.2790.0282.8760.287S100.5021102.02910.1601.9620.1950.2570.0260.2490.0252.8200.281

平均指对每个样品中的5种重金属分别平行测定两次,取其两次结果的平均值;含量指每千克甘草中重金属的含量

2.2 有机氯农药残留含量测定

2.2.1 气相色谱条件 固定液为(5%苯基)甲基聚硅氧烷的弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度设置为280 ℃,检测器温度设置为300 ℃,不分流进样。程序升温:初始温度100 ℃,然后以1 min升温10 ℃达到195 ℃,接着保持7 min升温8 ℃达到250 ℃,在250 ℃维持2 min。定量方法:外标法。

2.2.2 溶液的制备 对照品贮备溶液的制备:精密称取α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p,p′-DDE、p,p′-DDD、p,p′-DDT、o,p′-DDT、五氯硝基苯(PCNB)各对照品适量,用石油醚分别制成每1 ml约含5 μg的贮备液,备用。

混合对照品贮备溶液的制备:精密量取上述各对照品贮备液0.5 ml,置10 ml的容量瓶中,用石油醚稀释至刻度,摇匀,即得。

混合对照品溶液的制备:精密量取0,0.04,0.2,0.4,2,4 ml的混合对照品贮备液,分别置10 ml的容量瓶中,用石油醚定容至刻度,即得到浓度分别约为0,1,5,10,50,100 μg/L的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备:从甘草药材中各取供试品适量,粉碎过三号筛,精密称取2 g,置100 ml的具塞锥形瓶中,加水20 ml浸泡过夜,精密加丙酮40 ml,准确称定,超声处理30 min,冷却后再称定重量,用丙酮补足重量,再加氯化钠约6 g,精密加二氯甲烷30 ml,准确称定,超声15 min,再称定重量,用二氯甲烷补足重量,静置,分层后将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100 ml具塞锥形瓶中,放置4 h。精密量取35 ml,于40 ℃水浴上减压浓缩至近干,加少量石油醚重复操作至二氯甲烷及丙酮除净,用石油醚溶解并转移至10 ml具塞刻度离心管中,加石油醚精密稀释至5 ml,小心加入硫酸1 ml,振摇1 min,离心(3 000 r/min,10 min),精密量取上清液2 ml,置具刻度的浓缩瓶中,将溶液40 ℃下(或用N2)旋转蒸发浓缩至适量,精密稀释至1 ml,即得。

空白溶液的制备:同“2.2.2”项下供试品溶液的制备,但是不加甘草供试品,考察供试品溶液处理中所用试剂对测定结果的干扰。

2.2.3 标准曲线的绘制 按“2.2.2”项下配制的混合对照品浓度,采用气相色谱法测定,得α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p,p′-DDE、p,p′-DDD、p,p′-DDT、o,p′-DDT、PCNB的线性方程(见表4)。

2.2.4 精密度试验 精密吸取各浓度混合对照品溶液1 μl,连续进样5次,测定峰面积,计算RSD值为0-1.3%(小于2.0%),精密度良好。

2.2.5 加样回收率试验 从甘草中取已知含量的药材(编号S1)样品3份,精密称取2 g,分别加入高、中、低质量的9种有机氯农药残留混合对照品溶液,按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法处理、测定并计算加样回收率,结果见表5。从表中可以看出,9种有机氯的回收率满足了痕量分析加样回收率的要求,加样回收率良好。

表4 9种有机氯成分的线性方程

Table 4 Linear equations of nine organochlorines

有机氯成分线性方程 R2线性范围(μg/L)α-BHCy=14605.3875x+34679.39850.99770-250.0β-BHCy=6237.2361x+71557.92450.99060-255.0γ-BHCy=13252.2331x+23261.93050.99670-250.0δ-BHCy=12307.0932x+32965.24570.99710-252.5p,p′-DDEy=12950.8216x-2504.54130.99530-252.5p,p′-DDDy=8006.7381x+19025.98140.99750-257.5p,p′-DDTy=9941.8453x+6179.55090.99800-250.0o,p′-DDTy=8340.2613x+11504.83330.99630-252.5PCNBy=15103.6699x+90388.86240.99660-252.5

2.2.6 甘草中9种有机氯农药残留的含量测定 从前面10个编号的甘草药材中取供试品适量,精密称取2 g,按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法处理并测定,每批样品平行测定2次,结果见表6。《中国药典》(2015版)中有机氯农药残留限量规定:含总六六六不得过0.2 mg/kg;总滴滴涕不得过0.2 mg/kg;五氯硝基苯不得过0.2 mg/kg。从表6中可以看出,9种有机氯农药残留量实际测得量远远低于限量要求。

表5 有机氯测定中甘草加样回收率试验

Table 5 Recovery test of licorice in the determination of organochlorines

成分 取样量(g)本底值(ng)加标值(ng)平均测定值(ng/L)测得量(ng)回收率(%)α-BHC2.005026.5750.08.51×103 85.05117.02.004026.56100.014.30×103143.02116.52.005326.58150.017.09×103170.9396.2β-BHC2.00505.3651.05.99×10359.88107.02.00405.36102.011.59×103115.88108.42.00535.36153.014.10×103140.9588.6γ-BHC2.00502.5950.05.51×10355.12105.12.00402.59100.011.81×103118.08115.52.00532.59150.015.10×103150.9698.9δ-BHC2.00501.8350.56.07×10360.73116.62.00401.83101.012.78×103127.78124.72.00531.83151.516.03×103160.26104.6p,p′-DDE2.00502.5250.55.56×10355.62105.12.00402.52101.011.39×103113.86110.22.00532.52151.514.31×103143.0992.8p,p′-DDD2.0050051.55.38×10353.80104.52.00400103.012.40×103124.04120.42.00530154.515.20×103151.9898.4p,p′-DDT2.00504.7050.05.92×10359.22109.12.00404.69100.013.11×103131.07126.42.00534.70150.015.62×103152.0098.2o,p′-DDT2.0050050.55.33×10353.30105.52.00400101.012.37×103123.70122.22.00530151.514.76×103147.5897.4PCNB2.005034.4750.57.92×10379.1688.52.004034.45101.012.72×103127.1891.82.005334.48151.515.05×103150.5476.6

表6 甘草中9种有机氯农药残留的含量

Table 6 Contents of 9 organochlorine pesticide residues in licorice

批号取样量(g)α-BHCβ-BHC(μg/L)γ-BHC(μg/L)δ-BHC(μg/L)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)总六六六量(μg/kg)S1 2.00954.73211.7740.9902.4630.4651.1570.6801.69217.086S2 2.00885.32513.3131.0742.6730.5191.292--17.278S3 2.01663.3518.3090.7321.8150.3520.873--10.997S4 2.00452.5366.3260.4711.1750.4611.150--8.651S5 2.00412.7186.7810.5401.3470.2930.731--8.859S6 2.00353.5738.9170.8872.2140.4101.023--12.154S7 2.00893.3028.2180.5661.4090.4261.060--10.687S8 2.00303.4488.6070.5831.4550.5061.263--11.326S9 2.00801.9274.7980.3070.766----5.564S102.00902.2505.6000.3640.906----6.506

续表6 甘草中9种有机氯农药残留的含量

Table 6 Contents of 9 organochlorine pesticide residues in licorice

批号取样量(g)p,p′-DDEp,p′-DDDp,p′-DDTo,p′-DDT平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)总滴滴涕量(μg/kg)PCNB平均(μg/L)含量(μg/kg)S1 2.0095----0.5681.413--1.4136.31915.723S2 2.00880.5051.257--0.9412.342--3.5996.90717.192S3 2.0166----0.6081.508--1.5084.77511.839S4 2.0045------1.1352.8312.8313.8949.713S5 2.0041---------3.8779.673S6 2.00350.5271.315------1.3154.99312.461S7 2.00890.5411.347------1.3474.48611.165S8 2.00300.6231.555--0.6101.523--3.0784.84111.186S9 2.0080---------2.9117.249S102.0090---------3.3248.273

“-”表示未检出;平均指对每个样品中的9种有机氯分别平行测定两次,取其两次结果的平均值;含量指每千克甘草中每种有机氯残留的含量

3 讨论

本文所用甘草中Cu、As、Cd、Hg、Pb 5种重金属含量范围依次为Cu 9.810-10.680 mg/kg,As 0.195-0.224 mg/kg,Cd 0.026-0.029 mg/kg,Hg 0.025-0.034 mg/kg,Pb 0.281-0.336 mg/kg,9种有机氯农药残留的含量中总六六六的含量范围为5.564-17.278 μg/kg,总滴滴涕含量范围为0-3.599 μg/kg,五氯硝基苯(PCNB)的含量范围为7.249-17.192 μg/kg。

5种重金属元素和9种有机氯农药残留的含量均符合《中国药典》(2015版)限量要求。虽然在朔州采集的甘草在这两项上符合安全使用的要求,但全国范围内的中药材重金属污染问题仍然严峻[12],有机氯农药残留的污染也会随着人工培育药材变得愈演愈烈,考虑到重金属的长期蓄积效应[13,14]和有机氯农药残留的急性毒性。建议提高相应的限量标准,对中药材质量严格把关,进而保证患者用药安全、有效。

本文采用的ICP-MS和GC检测方法精密度高,重复性好,简便快捷,准确可靠,非常适用于重金属和有机氯农药残留的测定。