蛋白芯片法与胶体金法检测结核抗体对结核病的临床价值

仇祝强 于辉

肺结核是当前临床常见的一种通过呼吸道传播的传染性疾病，该病病死率居各类传染性疾病的第2位[1-2]。肺结核常见发病部位主要在肺部，该病患者在临床上多表现出夜间盗汗、低热以及咳嗽等症状[3]。该病作为消耗性疾病之一，在感染机体后引发Ⅳ型超敏反应（迟发型超敏反应），严重影响到患者的身体健康与生命安全[4]。对于该病需在临床上进行及早诊断、及早治疗与干预。当前主要通过培养与涂片等细菌学检查进行诊断，但由于对结核杆分枝菌培养的耗时较长，且进行痰涂片法检测的敏感性相对较低，细菌学检查方法难以取得较满意的效果。随着当前医学技术的不断进步，逐渐将结核抗体检测方法用于对结核病的筛选，当前主要采用的结核抗体检测方法包括蛋白芯片法与胶体金法[5-6]。研究主要以探讨分析胶体金法与蛋白芯片法两种方法检测结核抗体对结核病的临床诊断价值，内容见下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入本院2018年1—6月收治临床确诊活动性肺结核病患者68例建立观察组，同期纳入非结核病受检者80例建立对照组。观察组纳入患者均符合中华医学会结核分会2000年制定的肺结核诊断标准进行诊断。观察组纳入患者包括男性36例、女性32例，患者年龄21～67岁，平均（44.7±5.2）岁；对照组纳入受检者男性45例、女性35例，受检者年龄21～67岁，平均（44.9±5.1）岁。两组研究对象一般资料对比差异无统计学意义（P＞0.05），且受检者入组前均对研究内容知情同意。

1.2 方法

分别应用胶体金法与蛋白芯片法对研究对象进行结核抗体检测。（1）胶体金法检测。应用迪比多检验试剂盒（上海奥普生物公司）进行检测，通过斑点免疫-胶体金渗滤技术（DIGFA），对结核分枝杆菌的特异性膜蛋白抗原进行分离与纯化处理，于硝酸纤维素膜上进行点样并固定，使膜上结核抗原与血清样品当中的结核分枝杆菌抗体进行结合，结核IgG抗体通过葡萄球菌-A蛋白（SPA）的胶体金缀合物进行标记呈色，若发现存在红色斑点，可提示有结核分枝杆菌抗体存在。（2）蛋白芯片法检测。应用结核分支杆菌IgG抗体检验试剂盒（南京大渊生物）进行蛋白芯片法检测，检测按试剂盒说明书进行操作。蛋白芯片试剂盒应用经基因工程表达结核分枝杆菌所表达的LAM、16 KDa与38 KDa蛋白3种结核菌复合群的特异性抗原对受检血清中抗体进行检测，以任一抗体检测结果为阳性判定检测阳性。

1.3 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件处理数据，检测阳性率资料采用百分比形式描述，组间对比通过χ2检验，以P＜0.05表示对比差异存在统计学意义。

2 结果

观察组患者经胶体金法检测的阳性率77.94%（53/68），对照组受检者经胶体金法检测的阳性率7.50%（6/80），观察组与对照组胶体金法检测阳性率差异存在统计学意义（χ2=76.080，P＜0.05）；观察组与对照组的蛋白芯片法检测（LAM、16 KDa与38 KDa）阳性率差异存在统计学意义（LAM-χ2=52.271，16 KDa-χ2=40.628，38 KDa-χ2=52.271）。观察组胶体金法与蛋白芯片法16 KDa 检测对比，χ2=19.080，P＜0.05）；观察组患者胶体金法检测阳性率高于蛋白芯片法（观察组胶体金法与蛋白芯片法LAM、38 KDa检测相比，χ2均=4.224 9，P＜0.05），见表1。

3 讨论

结核病是当前全球感染性疾病致死的首要因素。临床上结核病主要是指在显微镜下或经培养存在阳性结核分枝杆菌的结果，或存在影像学以及结核病症状表现的一类感染疾病。对于结核病而言，分枝杆菌的培养是作为诊断感染的临床“金标准”，但由于分枝杆菌一般在固体培养基当中的生长周期相对较长（培养时间＞6周），因此分枝杆菌的培养不适宜对结核病的早期诊断[7]。而当前临床特异性较高，检验快速、简便的检测方法为抗酸染色法检测，但其诊断敏感性相对较低，进行一次痰涂片检测的诊断敏感性仅在20%～80%，对涂阴结果的结核病诊断，若无典型影像学证据结合诊断，则易导致发生漏诊或误诊现象。相比之下，通过血清免疫学对结核抗体进行检测的诊断方法则可弥补进行影像学检测的不足，当前临床常用检测方法主要包括蛋白芯片法与胶体金法技术[8-9]。胶体金法是通过斑点免疫胶体金渗滤技术对结核分支杆菌上的特异性膜蛋白抗原进行分离纯化处理，进一步捕获人血清样品当中的结核分枝杆菌抗体，经SPA胶体金缀合物进行标记呈色，从而形成红色斑点，该方法下可根据红色斑点的出现情况判断检验的阴、阳结果。而蛋白芯片法检测过程则涉及试剂盒的芯片与试剂，其中，芯片主要以微孔滤膜作为载体，将结核菌具有特异性的细胞壁脂多糖抗原LAM与景观基因工程DNA重组技术纯化的结核菌16 KDa蛋白、38 KDa蛋白等特异性抗原一同固定于特制载体，再经微孔滤膜进行渗滤、浓缩与凝集，捕捉特异性抗体，抗原抗体复合物与经胶体金标记处理兔抗人IgG的作用在膜上呈现紫红色斑点[10]。经芯片识别系统分析，可分别测定出抗结核菌具有特异性的细胞壁上脂多糖LAM、16 KDa与38 KDa抗体，蛋白芯片法检测以三种抗体之一呈现阳性，判断为该患者的抗结核分枝杆菌抗体检测阳性。其中，结核分枝杆菌LAM是作为结核分枝杆菌的细胞壁上一种重要成分，LAM的抗原性较强，能刺激结核菌感染者体内产生抗体，其他的分枝杆菌因细胞壁表面LAM的含量较低，无法刺激机体产生大量抗体，因此对LAM抗体的检测具有较高的特异性与敏感性。16 KDa蛋白的基因型是MPT63，MPT63基因仅出现于结核菌复合群，且16 KDa蛋白与常见鸟分枝杆菌相关蛋白不产生血清交叉反应，检测该指标同样能较好的反应结核分枝杆菌水平情况[11-13]。38 KDa蛋白是细胞所分泌的脂蛋白之一，38 KDa蛋白与细胞膜或菌体表面上的脂肪结构连接，在各类分枝杆菌中，只有结核菌与牛分枝杆菌两类被发现分泌38 KDa蛋白，且人结核菌反应强度相比于牛分枝杆菌的38 KDa蛋白分泌水平高10倍，临床通过蛋白芯片法检测38 KDa蛋白能较好的反映结核分枝杆菌感染。研究通过纳入临床确诊活动性肺结核病患者与非结核病受检者分别应用胶体金法与蛋白芯片法对研究对象进行结核抗体检测，结果显示，观察组患者经胶体金法检测的阳性率77.94%，对照组受检者经胶体金法检测的阳性率7.50%；观察组患者经蛋白芯片法LAM、16 KDa与38 KDa反应阳性率为61.76%，对照组蛋白芯片法反应阳性率为6.25%；观察组患者胶体金法检测阳性率显著高于蛋白芯片法。研究提示，胶体金法在活动性结核病和结核感染诊断的敏感性方面的优势更大，该方法用于对可疑结核病患者的检测能更准确的进行诊断。

表1 蛋白芯片法与胶体金法两种方法检测结核抗体阳性情况对比[例（%）]

综上所述，应用胶体金法对结核抗体进行检测的结核病阳性率与蛋白芯片法对比显著更高，胶体金法检测对早期活动性结核患者的诊断具有一定的辅助应用价值。