小麦选择性自噬关键基因NBR1 的原核表达

刘彦妮 杨文文 王华忠

摘    要：自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。NBR1是选择性自噬的底物受体之一，其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上，本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中，利用SDS-PAGE方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。结果表明，导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG诱导表达;表达重组蛋白两端含有His（6）标签，其表观分子量与理论分子量基本一致;重组蛋白在诱导后2 h即表现较高的表达量，并在诱导后4 h达到最高的表达量。研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制備以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。

关键词：选择性自噬;小麦;NBR1基因;原核表达

中图分类号：S512.1            文献标识码：A             DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.001

Prokaryotic Expression of The Wheat Key Selective Autophagy Gene NBR1

LIU Yanni， YANG Wenwen， WANG Huazhong

（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， School of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： Autophagy plays an important role in the growth， development， aging and stress responses of plants and animals. NBR1 functions in selective autophagy as a substrate receptor， which recognizes specific ubiquitinated proteins and presents them to the autophagic degradation process through its interaction with ATG8 on autophagic membranes. Previously， two wheat NBR1 genes were cloned in Tianjin key laboratory of animal and plant resistance. In this study， prokaryotic expression vectors for the two wheat NBR1s were constructed and transformed into E. coli. Results from SDS-PAGE showed that wheat NBR1s could express efficiently in E. coli through IPTG induction. The expressed recombinant proteins had N- and C- terminal His（6） tags， and their molecular weights were consistent with the predicted values. High levels of recombinant proteins were detected at as early as 2 h after IPTG induction， and the highest levels were reached at 4 h after IPTG induction. These results laid a foundation for the preparation of recombinant wheat NBR1 proteins and their antibodies for use in assays on the interaction and expression features of wheat NBR1s.

Key words： selective autophagy; wheat （Triticum aestivum L.）; NBR1gene; prokaryotic expression

自噬（autophagy）是一种保守的真核生物细胞内物质降解过程。在自噬过程中，细胞质物质被双层膜结构的自噬小体包裹，随后经自噬小体外膜与液泡或溶酶体膜的融合过程以内膜包裹的形式（此时称为自噬小泡）进入液泡或溶酶体腔中进行降解，降解产生的小分子可以作为营养物质重新利用[1]。自噬过程的执行依赖于多种自噬相关因子ATG（AuTophaGy-related factor）的参与[1]。ATG8蛋白定位于自噬膜表面，在自噬小体的组装及其与溶酶体/液泡膜的融合过程中发挥重要作用[2-4]。自噬分为批量自噬和底物特异性的选择性自噬，ATG8在选择性自噬的底物捕获过程中也发挥了重要作用[1]。自噬膜表面的ATG8通过直接与特异性底物互作或与其受体互作的方式将底物捕获到自噬小体中[5]。NBR1（Neighbor of BRCA1 gene 1）是目前鉴定到的重要选择性自噬底物受体/ATG8互作蛋白之一。NBR1含有泛素结合结构域和ATG8互作结构域，其一方面识别并结合泛素化蛋白，另一方面通过与ATG8的互作将其识别的底物引导进入自噬小体[6]。动物上有关NBR1研究的报道较多，发现其参与了蛋白质聚集体自噬[6]和过氧化物酶体自噬[7]过程的底物识别。植物NBR1先后在拟南芥[8]和烟草（称为Joka2）[9]上得到鉴定，证实了其与ATG8和泛素化蛋白质底物的互作，参与了胁迫条件下泛素化蛋白质聚集体和入侵病毒相关蛋白的选择性自噬过程[9-13]。到目前为止，重要农作物小麦上还未见有关选择性自噬和NBR1研究的报道。

本研究在前期克隆了小麦两个NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2的基础上，构建了两个基因的原核表达载体，实现了两个基因编码蛋白在大肠杆菌中的诱导表达，为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备和该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 基因、载体及试剂

克隆于质粒载体上的两个小麦NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2（均为全长cDNA）和原核表达载体pET30a由天津市动植物抗性重点实验室保存。实验用高保真DNA聚合酶primeSTAR、普通Taq酶、限制性内切酶（EcoRⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ）以及大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）菌株感受态细胞均为TakaRa公司产品;快速连接试剂盒（LigaFast）购自Promega公司;引物合成委托北京六合华大基因科技有限公司完成;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 原核表达载体的构建

设计合成用于扩增TaNBR1-1基因完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的引物对NBR1-F（GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCCGGCCTGA

GCGCG）/NBR1-R（GTG GTGGTGGTGGTGCTCGAG

CTTGTCCTTCTTCTCCCTGGC）和扩增TaNBR1-2基因完整ORF的引物对NBR2-F（GCCATGGCTGATA

TCGGATCCATGATGCCTCAACGGGACAC）/ NBR2-R（GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATCAGTTCCTTCA

GCTCCGC），扩增片段两端能够带上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点（TaNBR1-1）或BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点（TaNBR1-2）。使用引物對和高保真DNA聚合酶primeSTAR，分别以克隆有两个TaNBR1基因的质粒为模板进行PCR扩增。对扩增片段进行EcoRⅠ/XhoⅠ或BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，对载体pET30a质粒进行相应的双酶切。使用快速连接试剂盒（LigaFast）连接片段和载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α后，使用菌落PCR和酶切方法鉴定重组克隆即目标基因的表达载体。鉴定到的表达载体经测序进行进一步确认。采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。

1.3 原核表达

接种含有表达载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到2 mL含50 mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养过夜。按1 % 的比例扩大到10 mL 相同的液体培养基中，37 ℃ 振荡培养至对数生长期（3 h左右）。加入终浓度为0.5 mmol L-1的IPTG，于28 ℃条件下震荡培养诱导目标基因的表达。分别于诱导后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。

1.4 SDS-PAGE电泳

将收集的1 mL菌液于10 000 rpm条件下离心10 min，倒掉上清，用80 μL的ddH2O重悬沉淀，再加入20 μL的5倍上样缓冲液并混匀，沸水浴10 min裂解细胞变性蛋白。将裂解液于12 000 rpm条件下离心5 min，取20 μL上清进行SDS-PAGE电泳（12 % 分离胶，4 % 浓缩胶）。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色液染色1 h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 两个小麦NBR1基因原核表达载体的构建

TaNBR1-1基因原核表达载体的构建流程如图1A所示，设计合成5端分别添加了EcoRⅠ和XhoⅠ位点的正、反向引物，使用该引物对并以克隆有TaNBR1-1全长cDNA的质粒为模板进行PCR扩增获得两端添加了相应酶切位点的TaNBR1-1基因ORF片段，对ORF片段和pET30a载体进行EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切和连接，连接产物转化大肠杆菌后通过菌落PCR方法初步鉴定重组克隆。随后的EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定结果（图1B）表明，重组载体能够正确切出5 422 bp 的载体片段和2 613 bp的插入基因片段。重组载体经测序得到进一步确认，表明TaNBR1-1基因的原核表达载体构建成功，并将其命名为pET-TaNBR1-1。

TaNBR1-2基因原核表达载体的构建流程与TaNBR1-1基因类似，不同的是酶切位点选择的是BamHⅠ和XhoⅠ。BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定结果（图1C）表明，构建的重组载体能够正确切出5 422 bp 的载体片段和2 538 bp的插入基因片段。重组载体经测序得到进一步确认，表明TaNBR1-2基因的原核表达载体构建成功，并将其命名为pET-TaNBR1-2。

2.2 小麦TaNRB1-1基因的原核表达

将导入pET-TaNBR1-1载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）接种到LB培养基中并在28 ℃条件下进行震荡培养，培养基中添加了0.5 mmol·L-1 IPTG诱导目的基因的表达。于诱导后不同时间取1 mL菌液提取总蛋白进行SDS-PAGE分析（图2）。结果表明，诱导0 h的总蛋白中无目标重组蛋白条带，而经IPTG 诱导2 h后的总蛋白中出现两端融合组氨酸标签的His（6）-TaNBR1-1-His（6）重组蛋白条带，其表观分子量与理论分子量（101.6 kDa）基本一致。重组蛋白在诱导后2 h即表现较高的表达量，并在诱导后4 h达到最高的表达量。

2.3 小麦TaNRB1-2基因的原核表达

经IPTG诱导，导入大肠杆菌的TaNBR1-2基因也能正常表达出两端融合组氨酸标签的重组蛋白His（6）-TaNBR1-2- His（6），但表达量不高（图3）。重组蛋白在诱导2 h后开始出现，至诱导后4 h达到最高的表达量。重组蛋白的表观分子量稍大于理论分子量（97.28 kDa）。

3 結论与讨论

自噬过程的分子机制和生理功能是近年来生命科学的热点研究领域。NBR1是选择性自噬的重要底物识别蛋白之一。NBR1参与的选择性自噬与植物抵抗细菌[14]、卵菌[15-16]和病毒[12-13]的侵染密切相关，也与植物耐受高温、氧化、干旱和高盐等逆境胁迫密切相关[10]。围绕NBR1功能研究的核心内容是其与多种蛋白的互作机制（自身互作形成二聚体，与底物互作，与ATG8互作和与细胞骨架互作等）及这种互作的生理意义。开展pull-down、免疫共沉淀等蛋白质互作实验离不开目标蛋白的原核表达、纯化和相应抗体的制备。在选择性自噬过程中，NBR1与被其识别的底物蛋白一起进入自噬小体并最终在液泡中被降解。因此，细胞内NBR1的降解情况即NBR1的蛋白水平可以作为一个指标用于监测细胞内自噬流的强度，NBR1蛋白水平的下降预示着自噬流强度的上升[17-18]。此类依赖western杂交方法的蛋白质水平鉴定也需要利用原核表达的重组蛋白制备相应的抗体。目前植物NBR1的功能研究主要集中在模式物种拟南芥上，在围绕拟南芥NBR1的互作机制和基于该蛋白的自噬流强度监测研究的关键实验中都涉及该蛋白抗体的制备和使用[8，13-14，19]。

本实验室前期在重要农作物小麦上克隆了两个NBR1基因，正在对这两个基因及其参与的选择性自噬过程的生理功能开展深入研究。本研究构建了两个小麦NBR1基因的原核表达载体，实现了两个基因在大肠杆菌中的诱导表达，产生的两端融合His（6）标签的重组蛋白分子量与理论值基本一致。His（6）标签的存在方便了重组蛋白的纯化工作;诱导表达的时间规律分析确定了两个基因在诱导后4 h即可以达到最高的表达量。研究结果可为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备和该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。

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