外生菌根菌对油松幼苗抗氧化酶活性及根系构型的影响

祁金玉,邓继峰,尹大川,蔡立新,刘冬萍,张丽丽,林 梅

沈阳农业大学林学院, 沈阳 110866

油松(Pinustabulaeformis)为中国特有树种。它适应性强,根系发达,耐干旱耐瘠薄,是我国北方地区最主要造林树种[1],依赖菌根来吸收水分和养分以适应不良的环境条件[2- 3]。外生菌根具有促进油松生长,增强油松抗逆性的作用[4- 6]。

植物根系将植物固定在土壤中支撑着植物的地上部分,是植物吸收水分和养分的主要器官,根系的空间分布特征对其吸收水分养分的能力、根系生物量/根系生产力和根系动态变化有重要影响[7-8]。外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi；简称ECMF)侵染植株根系后,增加了植株根系的适应性,拓宽了植株获取营养的渠道。吴小芹等[9]研究接种黄色须腹菌(Rhizopogenluteous)、彩色豆马勃(Pisolithustinctorius)和美味牛肝菌(Boletusedulis)均能增加黑松(P.thunbergii)根系直径、吸收根的分布范围等根系参数。翟帅帅等[10]研究褐环乳牛肝菌(S.luteus)接种马尾松显著增加了马尾松根系总长度、表面积、体积等根系参数,扩展了根系分布范围。目前对油松根系的研究,主要有不同光照、施用有机碳肥等条件下油松根系变化情况,以及建立油松根系的三维静态模型[11- 13]。对于不同种类的外生菌根真菌接种后油松幼苗根系构型报道较少。

本研究通过对油松接种褐环乳牛肝菌(S.luteus)和红汁乳菇(L.hatsudake),以期促进油松幼苗苗高地径的增长,提高苗木理化性质,探讨两种ECMF对油松根系构型的促生效应,为培育优良的油松菌根苗木,提高造林成活率,提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油松种子由抚顺林业局提供。供试菌种：红汁乳菇(L.hatsudake)吉林农业大学惠赠；褐环乳牛肝菌(S.luteus)分离自辽宁省彰武县章古台实验林场。

1.2 试验准备

种子催芽：2016年4月20日播种,选取大小一致的油松种子,预先用0.5%高锰酸钾消毒30 min,无菌水冲洗数次后,用灭菌湿纱布包裹保湿,置于25℃人工气候箱中催芽,每天早、晚用无菌水各冲洗1次,直至出芽。

无菌土制备：试验用盆为营养钵(15 cm×12 cm×13 cm)。钵内预先装入121℃下高温高压灭菌2 h的混合土(草炭土∶蛭石∶河沙=2∶1∶1),每盆土量重约500 g。

菌剂制备：用直径5 mm的无菌打孔器,切取在平板培养基上培养好的褐环乳牛肝菌、红汁乳菇,分别接种于盛有250 mL PD液体培养基(配方：葡萄糖20 g,马铃薯200 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,H2O 1000 mL)的三角瓶中,每瓶接种3片菌饼。置于摇床上(25℃、160 r/min)振荡培养,得到液体菌剂。使用前按照菌剂和水体积为1∶3的比例混合,用搅碎机将菌丝体搅碎做匀浆处理,备用。

1.3 试验设计

试验设置3种处理方式：

处理1：接种无菌PD培养基(CK)；

处理2：接种红汁乳菇(LH)；

处理3：接种褐环乳牛肝菌(SL)。

待幼苗成活定株后,采取打孔灌根接种的方式接种红汁乳菇和褐环乳牛肝菌,每盆接种50 mL菌剂。CK施以等量无菌PD培养基。每个处理10次重复,每盆5株苗,共30盆,150株苗。

1.4 测定方法

1.4.1菌根侵染率

在苗木生长4个月后,每处理随机挖取油松幼苗10株,在体式镜下观察菌根形态,测定菌根侵染率。

外生菌根侵染率采用统计计算法。将根样剪成1 cm等长的根段,随机选取根样,每样100个根段,在体视镜下观察外生菌根侵染率。

1.4.2苗木生长指标测定

每处理随机取样10株,轻轻抖掉表面土,流水冲掉根部附着土,用卷尺和游标卡尺分别测量植株的苗高、地径；用吸水纸吸干水分电子天平称取鲜重,80℃烘干至恒重称取干重。

1.4.3苗木抗氧化酶活性

分别选取不同处理油松苗相同部位针叶和根系取样,利用南京建成试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性。

1.4.4苗木根系参数测定

根系生长：扫描仪对不同处理的根系进行扫描、分级。用万深LA-S植物根系分析系统对根系长度、投影面积、表面积、体积、平均直径、根尖数、分枝数、交叉数等指标进行分析。

根系空间构型：测定一级侧根与主根的夹角,根据吴小芹[11]方法将一级侧根分为3类(Ⅰ：<60°侧根；Ⅱ：60°—80°侧根；Ⅲ：80°—90°侧根),计算各类角度侧根占一级侧根总数的比例。

1.5 数据统计

数据用SPSS进行单因素差异显著性分析,α=0.05,并用平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 油松幼苗的菌根侵染率及形态观察

油松幼苗菌根侵染率见表1,菌根形态见图1。由表1可知,两种外生菌根菌均能与油松形成外生菌根,其中褐环乳牛肝菌与油松菌根合成率最高为68.62%,红汁乳菇与油松菌根合成率为62.12%,二者差异不显著。

褐环乳牛肝菌与油松可形成棒状和二叉状分支的菌根；红汁乳菇与油松形成的菌根中只观察到棒状菌根。形成菌根的苗木根系前端有膨大增粗,呈盾圆形。对照未形成菌根根系前端平齐。

图1 形成菌根形态(20×)Fig.1 The formation of mycorrhizal synthesis(20×)CK：对照Control check；LH：红汁乳菇Lactarius hatsudake；SL：褐环乳牛肝菌Suillus luteus

2.2 不同外生菌根菌对油松幼苗生长的影响

对照油松生长纤细,针叶稀疏,接种红汁乳菇和褐环乳牛肝菌处理油松幼苗生长健壮,针叶较对照茂密,其中接种褐环乳牛肝菌油松针叶尤其茂盛。

接种处理均能显著提高油松的苗高、地径；地上和地下部分的鲜重、干重。不同接种处理只有地径差异不显著(P>0.05),接种褐环乳牛肝菌相比接种红汁乳菇的苗木苗高增加12.17%；地上和地下部分的鲜重增加37.68%、60.68%;地上和地下部分的干重增加40.11% 、61.64%。

表1 不同处理对幼苗生长的影响

CK：对照Control check；LH：红汁乳菇Lactariushatsudake；SL：褐环乳牛肝菌Suillusluteus

2.3 不同外生菌根菌对油松幼苗抗氧化酶活性的影响

不同处理油松幼苗抗氧化酶活性见表2。接种外生菌根菌的油松幼苗针叶和根系SOD、POD、CAT 3种抗氧化酶活性均大于不接种处理,经方差分析接种处理与对照CK存在显著差异。接种褐环乳牛肝菌幼苗针叶的抗氧化酶活性均大于接种红汁乳菇幼苗,其中SOD活性比接种红汁乳菇的高14.77%,POD活性高20.77%,CAT活性高34.68%；根系中抗氧化酶活性也均大于接种红汁乳菇幼苗,分别高出8.54%,4.34%,33.31%。

表2 不同处理对幼苗针叶和根系抗氧化酶活性的影响/(U g-1s-1)

2.4 不同外生菌根菌对油松幼苗根系构型的影响

2.4.1根系参数

不同处理根系生长参数测定结果见表3。接种处理显著提高了油松根系长度、表面积、体积、平均直径、根尖数、分叉数。接种褐环乳牛肝菌和红汁乳菇处理与对照相比,根系长度分别增加12.82%和19.15%；表面积分别增加70.37%、69.81%；根系体积分别增加92.34%、92.61%；根系平均直径均增加66.67%；根尖数分别增加92.24%、88.13%；分叉数分别增加79.29%、80.41%。

表3 不同处理幼苗根系生长参数

2种接种处理根系参数中根系长度增加幅度较小,在10.00%—20.00%之间；其余指标均增加60.00%以上。方差分析表明接种处理与对照均存在显著差异,两种接种处理间只有根尖数存在显著差异,其他根系参数指标均差异不显著。

2.4.2油松不同菌根幼苗根系空间构型

不同处理油松幼苗的根系分布情况见图2、图3。

图2 不同处理油松根系形态Fig.2 Pinus tabulaeformisroot morphology under different treatments

图3 油松不同外生菌根苗木根系不同角度一级侧根所占比例 Fig.3 The occupation of primary lateral roots in the different angle of branch under different the mycorrhizal inoculation

由图2可见接种褐环乳牛肝菌的油松根系构型明显优于接种红汁乳菇和对照。由图3可见接种褐环乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一级侧根占23.81%,60°—80°的一级侧根占16.65%,<60°的一级侧根占59.54%；接种红汁乳菇幼苗根沿主根分支成80°—90°的一级侧根占13.3%,60°—80°的一级侧根占17.34%,<60°的一级侧根占69.36%；对照幼苗根沿主根分支成80°—90°的一级侧根仅占2.41%,60°—80°的一级侧根占4.91%,<60°的一级侧根占92.68%。其中褐环乳牛肝菌80°—90°的一级侧根最多,红汁乳菇次之,对照根系中所占比例最少,因而接种褐环乳牛肝菌幼苗的根系沿根围不同方向生长范围最广,对照根系中80°—90°的一级侧根少,限制了根系的横向生长。

3 结论与讨论

研究结果表明,在实验室条件下选用的两种外生菌根菌均能与油松合成典型的外生菌根,菌根侵染率超过60%。低于刘强[14]褐环乳牛肝菌与油松的菌根合成率和翟帅帅等[10]褐环乳牛肝菌与马尾松菌根合成率,这可能是因为不同采集地点菌株差异、不同寄主植物间差异或菌剂施用浓度的差异。褐环乳牛肝菌与油松主要形成棒状和二叉状菌根；红汁乳菇与油松主要形成棒状菌根,试验中未观察到其他形态菌根。研究结果同时表明,两种外生菌根接种处理均显著提高了油松幼苗的苗高、地径、干重、鲜重。

CAT、POD 和 SOD 是植物体内主要的抗氧化酶系,通过它们的变化程度可以反映植物的抗逆性[15]。SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线在生物体中普遍存在,它将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢,控制细胞膜脂过氧化,接着由 CAT 和 POD 立即将过氧化氢分解为无害的水[16- 17]。在正常的条件下,植物体内酶彼此协调,防御系统中酶的活性高低就成为控制伤害的决定因素,也能较好地反映植物对逆境的适应能力[18]。本研究中接种外生菌根油松幼苗的针叶和根系3种抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性显著高于不接种处理,两种外生菌根菌处理间褐环乳牛肝菌针叶和根系抗氧化酶活性均高于红汁乳菇处理,其中只有根系POD活性间无显著差异,其余均具有显著差异。

生长指标可以直接评价苗木生长的好坏程度。油松接种两种外生菌根菌后,苗高、地径等生长指标有了显著提高,说明选用的两种外生菌根菌均具有促进苗木生长的作用。褐环乳牛肝菌与松科合成菌根的研究较多,红汁乳菇研究报道较少,周崇莲等[19]报道了红汁乳菇与马尾松形成菌根促进生长；薛振文等[20]研究了与马尾松接种适宜的红汁乳菇菌剂量；李小利[21]研究了红汁乳菇与黑松能形成菌根,其他大多是野外调查红汁乳菇与松科植物的菌根情况[22]。本研究证明红汁乳菇也能在人工条件下与油松形成菌根,并促进油松生长。但研究结果表明接种褐环乳牛肝菌对油松幼苗生长及生物量的积累作用优于红汁乳菇,同时,接种褐环乳牛肝菌的油松苗木针叶和根系中保护酶活性均高于红汁乳菇接种苗木。生长健壮的苗木,其体内抗氧化酶系也相应的高,进一步从生理角度证明适宜接种褐环乳牛肝菌培育油松壮苗。

根系长度、表面积和体积是衡量植物根系分布范围的重要参数,接种红汁乳菇和褐环乳牛肝菌增加了油松根系总长度、表面积和体积。平均根系直径、根尖数、分叉数是衡量根系吸收功效的重要参数,接种红汁乳菇和褐环乳牛肝菌增加了油松根系平均直径、根尖数、分叉数。这与翟帅帅等[10]在褐环乳牛肝菌对马尾松根系构型的促进作用的研究结果一致。

不同处理油松幼苗的根系各不同角度的根分布不均衡,其中接种褐环乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一级侧根占23.81%,显著大于红汁乳菇接种处理,<60°的一级侧根显著低于红汁乳菇处理。结合根系生长参数、一级侧根角度综合看,虽然在根系总长度、表面积等参数上红汁乳菇和褐环乳牛肝菌作用基本相同,但接种褐环乳牛肝菌油松幼苗一级侧根角度中80°—90°的一级侧根最多,有利于根系扩大沿根围向不同方向生长的范围,表明褐环乳牛肝菌形成的油松根系发达、分布范围广,更利于养分和水分的吸收。所以接种褐环乳牛肝菌的处理方式更有利于油松生长。对照根系中80°—90°的一级侧根很少,限制了根系的横向生长。一旦外生菌根菌与树木根形成外生菌根后,特殊结构和根-菌互作,使外生菌根具有诸多功能。有些地区缺乏外生菌根菌,在常规造林的过程中使其自然感染菌根真菌是相当难的,为了达到更高的油松造林成活率,人为菌根化苗木的培育就显得十分重要。

由于研究条件等的限制,相比较地上部分功能形状的研究,根系研究仍相对滞后[23]。本研究中选用传统方法中的容器法,由于受容器限制,会抑制或影响根系生长,从而致使观测数据与实际情况的不符,还需要今后利用苗圃等野外实验条件进一步实验。