血小板活化标志物、维生素D与氯吡格雷抵抗的相关性

陈亮，刘媛，梁林，董娜，刘志忠,2

1.中国康复研究中心北京博爱医院检验科，北京市100068；2.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，北京市100070

缺血性脑卒中发病与血小板黏附、聚集率增加密切相关，因此，缺血性脑卒中患者需要长期规律服用抗血小板药物。我国临床应用最多的抗血小板药物是阿司匹林和氯吡格雷[1]，然而临床上部分患者应用效果欠佳。抗血小板治疗后高残留血小板反应性(抗血小板药物抵抗)增加了再发缺血性血管事件的风险[2-3]。亚洲人中，氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR)发生率为20%～65%，远高于其他人种[4]。

血小板活化是动脉粥样硬化血栓的标志特征之一，血小板活化后血小板聚集率增加，平均血小板体积增大，氧自由基、血栓素和血小板活化因子合成明显增加。血小板P选择素又称CD62p，是一种存在于血管内皮细胞Weibel-Palade小体膜和血小板α颗粒膜上的糖蛋白，主要通过介导粒细胞和单核细胞在血管内皮细胞表面的滚动，以及促使血小板与滚动细胞的黏附，在炎症和血栓形成等方面起重要作用[5]。血小板活化受多种因素影响，如高糖[6]、炎症因子[7]、脂多糖、病毒感染等。近年来，人们发现25-羟维生素D(25-hydroxyvitamin D,25-OHVitD)具有广泛的生物学效应，除参与经典钙磷代谢调节外，还参与免疫调节及多种细胞的分化、增殖。血小板线粒体有维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)表达，表明维生素D可以通过VDR的线粒体非基因组活性或钙信号的直接调制，调节血小板活化[8-9]。

基于P选择素、维生素D与血小板活化的潜在联系，我们系统分析它们与缺血性脑卒中患者抗血小板药物抵抗的相关性，以期发现药物抵抗的预测因子。

1 资料与方法

1.1 一般资料

连续收集2017年6月至2018年6月中国康复研究中心北京博爱医院的缺血性脑卒中住院患者190例，均符合中华医学会神经病学分会脑血管病学组制定的中国急性缺血性脑卒中诊治指南的诊断标准，并经头颅CT和MRI证实。

纳入标准：①TOAST分型为动脉粥样硬化型脑梗死和小动脉闭塞型脑梗死；②患者和家属知情同意。

排除标准：①伴阿尔茨海默病；②入院时有发热、缺氧、意识障碍及血流动力学障碍；③对乙酰水杨酸过敏；④近1周内有使用除阿司匹林外的非甾体抗血小板药、低分子肝素、华法林等影响血小板聚集功能的药物；⑤血小板计数＞450×109/L或＜100×109/L；⑥并发较严重的肝、肾功能不全，或肿瘤、免疫系统和呼吸系统等疾病；⑦近1个月内曾经历手术或严重外伤。

本研究获我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 资料收集

收集患者的一般情况(年龄、性别、身高、体质量等)、既往病史(高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、卒中史等)、个人史(吸烟、饮酒史等)、服药史、家族史、实验室检查和影像学资料(CT或MRI)。

1.2.2 抗血小板治疗

入院后给予吸氧，监测血压、心率等，根据情况调整血压、血糖、血脂，保持呼吸道通畅，进行营养支持。符合条件的患者予尿激酶、纤溶酶原激活剂等溶栓治疗。

入组患者均按中国急性缺血性脑卒中诊治指南进行抗血小板治疗，即非心源性缺血性卒中患者早期短程使用阿司匹林联合氯吡格雷，此后长期阿司匹林或氯吡格雷单药治疗[1]。阿司匹林(国药准字J20130078，Bayer S.p.A)入院时予负荷剂量300 mg，之后100 mg/d。加服氯吡格雷(国药准字H20056410，赛诺菲制药有限公司)，入院时予负荷剂量300 mg，之后75 mg/d。3周后予阿司匹林或氯吡格雷单药治疗。

阿司匹林联合氯吡格雷治疗7～10 d，采集静脉血行血小板功能和生化指标检查。

1.2.3 光比浊血小板聚集仪实验

用2支3.8%枸橼酸钠抗凝真空采血管采集静脉血。血细胞分析仪测定血浆的血小板浓度，用贫血小板血浆调整血小板浓度为(200～300)×109/L，检测血小板聚集率。

应用LBY-NJ4A全自动血小板聚集仪(北京泰利康信科技有限公司)以及二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)诱导剂(美国SIGMA公司)，比浊法测定ADP、AA诱导的最大血小板聚集率(maximum platelet aggregation rates,MPAR)。采血后分别加5 μmol/L ADP10 μl、0.5 mg/L AA 13μl，3 h内测定MPAR。AA诱导的MPAR≥20%者定义为阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)，否则为阿司匹林敏感(aspirin sensitivity,AS)；ADP诱导MPAR≥50%者定义为CR，否则为氯吡格雷敏感(clopidogrel sensitivity,CS)[10]。

1.2.4 CD62p活化百分率

使用FACSCalibur流式细胞仪及其配套试剂(美国BD公司)。荧光素标记抗血小板单克隆免疫荧光染色，阴性对照管中加鼠IgG1-FITC、CD61-PE各20μl，测定管中加入CD62pFITC 20μl，再加入全血5μl。室温(24～28℃)避光反应15 min，立即加入1%多聚甲醛(2～6℃)110 ml混匀，2～8℃阴暗处放置30 min，立即上机获取数据。

1.2.5 血浆P选择素

血浆500μl冻存，酶联免疫吸附试剂盒(武汉CUSABIO生物技术公司)测定血浆P选择素浓度。

1.2.6 血液生化指标及维生素D

采空腹肘静脉血4 ml，3000 r/min离心10 min，当天检测。采用全自动生化分析仪(迈瑞BS2000M)检测血液生化指标。采用Cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏公司)和配套试剂检测血清25-OHVitD浓度。25-OHVitD＜10 ng/ml为维生素D缺乏，10～20 ng/ml为维生素D不足，20～30 ng/ml为维生素D临界，＞30 ng/ml为维生素D营养充足。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计数资料比较采用χ2检验；计量资料符合正态分布的，以(xˉ±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。以是否发生CR为因变量，以单因素分析有显著性差异的变量为自变量，进行多因素Logistic回归分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

AR率1.2%，CR率24.7%。由于AR数量少，本研究只分析CR的相关因素。

按是否发生CR将患者分为CR组(n=47)和CS组(n=143)。CR组高血压患病率高于CS组(P＜0.05)，其他临床参数和生化参数两组间均无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

CR组CD62p活化百分率、25-OHVitD和MPAR均明显高于CS组(P＜0.01)，P选择素两组间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。CR组维生素D缺乏、不足和临界的患者百分比分别为72%、25%和3%，CS组分别为25%、66%和9%(χ2=44.246,P ＜ 0.001)。

多元Logistic回归分析显示，高血压、CD62p活化百分率是CR的危险因素，25-OHVitD是CR的保护因素。见表3。

3 讨论

高残留血小板反应性与多种因素有关，包括蛋白组学、代谢组学因素(糖代谢、吸烟、肾功能等影响肝酶或血小板受体表达)和基因组学因素(细胞色素酶P450、P2Y12基因多态性等)等[11]。对于CR患者，可增加氯吡格雷剂量。Wu等[12]对高残留血小板反应性者予双倍剂量氯吡格雷(150 mg/d)治疗，发现血小板反应性显著降低，而不会增加出血性事件的发生率。但也有研究显示[13]，高剂量氯吡格雷无法克服CR。

血小板活化后，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放，使CD62p重新分布于血小板表面，且部分进入血循环中。CD62p是最具特征性的血小板活化标志物，血液中CD62p的表达(可溶性P选择素)可反映血小板晚期活化状态[14]。胡晓芳等[15]研究显示，CD62p表达水平与血小板聚集水平呈正相关。黄涛[16]等发现，CD62p活化百分率与脑梗死体积呈正相关，而抗血小板药可有效抑制血小板活化，降低血小板CD62p表达。血小板CD62p可能与高残留血小板反应性有关。

本研究显示，CR组CD62p活化百分数高于敏感组，提示血小板高活化状态是导致药物抵抗的因素之一。而血浆可溶性P选择素浓度与氯吡格雷抵抗无关，一方面由于其反映血小板晚期活化状态[14]，另一方面由于内皮细胞被激活，内皮细胞P选择素表达上调[17]，并部分释放入血，因而不能特异地反映血小板活化状态。

表1 CR组和CS组一般情况及危险因素比较

表2 两组血浆P选择素、血小板CD62p活化百分率、维生素D及MPAR的比较

表3 CR组的多因素Logistic回归分析结果

维生素D是一种脂溶性维生素，在体内主要以25-OHVitD存在，反映维生素D的饮食摄入和皮肤合成[18]。血小板上存在VDR[8]，因而血小板功能受到维生素D影响。维生素D缺乏对止血和血栓形成的不良影响在体外和动物实验中得到证实。维生素D可以减少纤溶酶原激活剂Ⅰ、组织因子和血栓调节蛋白的表达[19]。本研究显示，维生素D缺乏在缺血性脑卒中患者中普遍存在，而CR患者尤为突出。

维生素D不足影响血小板功能。与生理盐水对照组相比，用骨化三醇预处理健康人和糖尿病患者血小板，能显著降低ADP诱导的血小板聚集率[20]。在稳定型心绞痛患者中，维生素D水平与平均血小板体积呈负相关[21]。而平均血小板体积与冠心病、急性冠脉综合征、高血压、脑卒中以及包括死亡率在内的不良结果的增加率或风险有关，平均血小板体积升高是心、脑血管疾病患者潜在的预后生物标志物[22]。维生素D降低可能促进血小板活化，导致高血小板聚集率。维生素D对血小板CD62p表达的抑制作用及其分子机制需要进一步研究。

血尿酸浓度与血小板反应性关系的研究有不同结论。尿酸升高是动脉粥样硬化的危险因素之一。Yildiz等[23]认为，高尿酸导致阿司匹林抵抗。Barbieri等[24]认为，尿酸浓度不影响阿司匹林、氯吡格雷和替格瑞洛的反应性。我们认为，患者患病期间，临床对这些传统的动脉粥样硬化因素进行了有针对性的治疗和控制，医疗因素改变了患者尿酸基线浓度，从而导致研究结果的差异。

本研究显示，高血压是CR发生的独立风险因素，与其他关于中国人群的研究一致[25-26]。

本研究显示，低维生素D水平、血小板CD62p活化百分率增加是缺血性脑卒中患者发生CR的独立风险因素。进一步研究应探索改善这些风险因素对氯吡格雷抵抗和卒中后不良事件发生的影响。