四物汤中多糖水提工艺的优化研究

周菲，江华娟，何瑶，姬梦姣

四物汤是中医补血之经典基础方剂，东汉张仲景所著《金匮要略》中的胶艾汤除去阿胶、艾叶、甘草后即为四物汤。四物汤最早收载于唐代蔺道人所著的《仙授理伤续断秘方》，用于治疗外伤淤血疼痛；后收载于我国第一部官方制剂规范《太平惠民和剂局方》，主要用于治疗月经不调、恶露不止等妇人诸证[1-2]。全方四味药组成，熟地黄为君药，可滋养阴血，补肾填精；当归为臣药，可补血养肝、活血调经；白芍为佐药，可和营养肝；川芎为使药，可活血行滞[3]。

现代研究表明，多糖是中药发挥药效作用的重要物质基础，参与机体的生理代谢，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗突变、抗辐射等多种生物活性[4-5]。四物汤中含有大量多糖类成分，是其主要有效部位之一，具有补血、促进小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子等作用[6-8]。目前四物汤多糖的研究主要集中在四物汤中单味药多糖药效作用的研究，研究指出方中熟地黄多糖可增强机体免疫能力，同时还具有抗氧化、抗突变等多种作用[9-10]；当归多糖具有较好的抗肿瘤、促进造血功能和调节免疫系统等作用[11-12]；白芍多糖具有增强免疫、抗肿瘤、抗糖尿病等作用[13-14]；川芎多糖则具有较强的抗氧化活性[15-16]。四物汤作为一个复方，复方多糖中多糖的配伍或相互影响使得多糖的作用更加多样化，其多糖的生物学效应也表现在更多方面，而目前四物汤复方多糖的药效、制备工艺和质量控制研究却少见报道。在中药制剂研究中，药物适合的制备工艺和严格的质量控制是准确研究药效的基础，中药复方成分复杂多样，其含量和结构会随着提取工艺的不同而发生一定变化，为了更深入、更准确的研究四物汤多糖，笔者建立了用紫外分光光度法测定四物汤复方多糖的含量测定方法，并以多糖含量为评价指标，采用L9(34)正交试验法优选四物汤多糖的水提工艺条件，为四物汤多糖的进一步研究开发提供基础依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-6100型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；DZF-1B型真空干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；DGG-9030型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JJ600Y型电子天平（常热市双杰测试仪器厂）；BP211D型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DL-720D数控超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。

1.2 试药

D(+)-无水葡萄糖（批号：MUST-16012910，纯度99.85%），购于成都曼斯特生物科技有限公司；浓硫酸、苯酚、无水乙醇、乙醇、丙酮、乙醚均为分析纯,均购于成都市科隆化学品有限公司。

熟地黄饮片（产地：河南，批号：G02717J01）、当归饮片（产地：甘肃，批号：G02617M01）、白芍饮片（产地：安徽，批号：G01217P01）、川芎饮片（产地：四川，批号：G02217H01），均购于四川中庸药业有限公司。经鉴定，依次来源于玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥块根炮制品；伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels. 的干燥根；毛莨科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根；伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，均符合《中国药典》2015年版相关项下要求。

2 方法与结果

2.1 粗多糖的含量测定

2.1.1 溶液的制备…对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10 mg置100 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解，并用蒸馏水定容至刻度，配制成质量浓度为100 μg．mL-1的对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液1,2,3,4,5,6 mL，各自置于10 mL的容量瓶中，并分别加蒸馏水定容至刻度，配制成质量浓度分别为10,20,30,40,50,60 μg．mL-1系列浓度的葡萄糖对照品溶液。另取2 mL蒸馏水作为空白调零。

5%苯酚试剂的配制: 称取精制苯酚5.0 g,加蒸馏水溶解并定容至100 mL，混匀，即得5%苯酚试剂，置于棕色瓶中备用。

供试品溶液的制备：取熟地黄、白芍、当归、川芎各10 g,将中药材饮片粉碎成粗颗粒（其中熟地黄剪碎）,加水浸泡0.5 h,按因素水平表加入一定量水加热煎煮一段时间，滤过，合并滤液，将滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃），加入适量乙醇，使含醇量达到80%，在冷处静置12 h，滤过，沉淀用丙酮、乙醚、无水乙醇依次反复冲洗，真空干燥，称重。精密称取上述干燥至恒重的沉淀物40 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，摇匀，并定容至刻度，从50 mL容量瓶中精密量取3 mL置20 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度，即得供试品溶液。

2.1.2 标准曲线的制备…分别取葡萄糖对照品系列溶液1 mL，各自置于10 mL具塞试管中，分别加入5%苯酚试剂1 mL,再迅速滴加浓硫酸5 mL，立即充分摇匀，盖上玻璃塞，室温放置30 min。以1 mL蒸馏水同上操作作为空白对照，按紫外分光光度法在490 nm波长处测定吸光度(A)。以吸光度(A)为纵坐标，葡萄糖质量浓度(C)为横坐标进行线性回归，得到回归方程为：Y=0.01523X+0.06867，r=0.9980(n=6)，结果表明葡萄糖在10～60 μg．mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验…取“2.1.1”项下方法制备的同一份葡萄糖对照品溶液1 mL，按照“2.1.2”项下方法测定吸光度，连续测定6次，测得吸光度的RSD值为0.27%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 重复性试验…按照“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密量取1 mL，按照“2.1.2”项下方法测定吸光度，测得多糖含量的RSD值为2.25%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验…按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取1 mL，按照“2.1.2”项下方法分别于30,60,90,120,150,180 min测定吸光度，测得多糖含量的RSD值为0.52%，表明该方法稳定性良好。

2.1.6 加样回收率实验…精密吸取6份已知葡萄糖含量的供试品溶液1 mL,置于10 mL具塞试管中，分别精密加入10,20,30,40,50,60 μg．mL-1葡萄糖对照品溶液1 mL，按照“2.1.2”项下方法测定吸光度,测得多糖的平均加样回收率为100.09%，RSD值为2.05%，结果表明该方法回收率良好，结果见表1。

2.2 正交试验优化提取工艺

2.2.1 正交实验设计…取熟地黄、白芍、当归、川芎饮片各10 g，共9份，以提取时间(A)、料液质量比(B)和提取次数(C)为考察因素，以多糖含量作为评价指标，按L9(34)正交表进行试验，测定多糖含量。对试验结果进行直观分析和方差分析，筛选四物汤多糖的最佳水提工艺条件，因素水平见表2，正交试验结果及直观分析结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 水提工艺正交试验因素水平

表3 水提工艺正交试验结果

K1 147.30 134.66 80.68 161.62 K2 147.93 165.07 186.94 177.05 K3 189.37 184.87 216.98 145.93 R 14.02 16.74 45.43 10.37

表4 水提工艺正交试验方差分析表

从直观分析的极差大小来看，各因素对四物汤多糖提取工艺的影响因素主次分别为:C＞B＞A，即提取次数对多糖含量影响最为明显，其次为料液质量比和提取时间。从各因素不同水平综合评分的均值大小来看，因素A的优劣次序为3＞2＞1，因素B的优劣次序为3＞2＞1，因素C的优劣次序为3＞2＞1。

从方差分析结果来看,因素C的P值小于0.05,说明因素C对四物汤多糖的提取具有显著性影响；考虑省时降耗及实际生产情况,确定四物汤多糖的最佳水提工艺条件为A1B2C3,即加入8倍量水，回流提取1h，共提取3次。

2.2.2 工艺验证…为了进一步验证所选提取工艺的科学性与稳定性，取熟地黄、白芍、当归、川芎饮片各10 g，共3份，按正交实验优选出的最佳水提工艺条件A1B2C3提取四物汤多糖，制得样品后按照“2.1.2”项下方法测定其吸光度，并通过标准曲线计算多糖的含量。结果显示3次实验测定值基本平行，多糖含量分别为71.31、69.58、70.59 mg．g-1，平均含量为70.49 mg．g-1，验证实验结果与正交试验结果基本吻合，表明该工艺合理、稳定性好，可行性高。

3 讨论

本实验采用正交设计来优化四物汤多糖的提取工艺[17]。多糖的提取方法较多，常规的提取方法有溶剂提取法、超声提取法、超高压提取法、微波法等，其中溶剂提取法最为常用，提取媒介有水、酸、碱等[18]。根据相似相溶原理，水是较好的提取媒介，且考虑到提取方法的操作和设备要求，故本次实验采用水煎法进行四物汤多糖的提取。在纯化多糖时，考虑到多糖难溶于一定体积分数的乙醇，课题组通过预实验发现当含醇量达到80%时多糖的沉淀效果最佳，沉淀较为完全，故本次实验采用在提取液中加入乙醇使含醇量达到80%来沉淀多糖。

测定多糖含量的方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、高效液相色谱法、酶法等。高效液相色谱法与酶法因测定时间较长、测定成本较高等原因，不被广泛使用；而苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法检测迅速、实用性强，现已广泛应用于多糖的含量测定研究中[19-21]。实验中课题组考虑到蒽酮-硫酸法易受蛋白质等杂质的干扰，故本次实验采用苯酚-硫酸法来测定多糖的含量。该法操作简单、灵敏度高，且基本不受蛋白质存在的影响，能有效地测定四物汤中多糖的含量。

多糖是一类重要的天然活性物质，具有调节免疫、延缓衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等众多生物活性，且对机体毒副作用小，来源广泛。目前，多糖的研究多集中在药效方面，而多糖的提取工艺、含量测定、构效关系等方面的研究还有待深入。药物的制备工艺和质量控制极其重要，不同的制备工艺会引起药物化学成分结构和含量的改变，从而影响药物的药理活性。四物汤作为一个补血调经的名方，近年来关于四物汤复方多糖的研究却鲜有报道，其在制备工艺、质量控制和药效研究等方面还存在很大研究空间。本文以四物汤多糖的含量测定和提取工艺为研究点，建立了用紫外分光光度法测定四物汤多糖的含量测定方法，优选出了四物汤多糖的最佳提取工艺，实验结果表明，建立的含量测定方法简便可靠，稳定，重复性好，灵敏度高；优选的工艺条件稳定合理，重复性好，可行性高，该方法和工艺条件为四物汤多糖的制备和质量控制提供了参考，亦为以后四物汤多糖的药效等深入研究提供了相关依据。