ELP2/STAT3/SETD2基因组拷贝数变异与胃癌化疗反应的相关性研究*

刘琼茹，黄秀芳，梁津杰，方晓华，蔡育波，杨文丽，黄 辉，陈艳虹，陈仙兰，张 鑫,2，林碧华

(1.广东省江门市中心医院病理科 529030；2.广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；3.广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东东莞 523808)

胃癌(gastric carcinoma)是常见的消化道恶性肿瘤，其中胃腺癌最为常见，可占85%以上。我国的胃癌发病率一直较高，从2004年后便居于发病癌谱的第二位[1]。2015年我国新发胃癌患者估算为67.9万，其中男性47.8万、女性20.1万，同期因胃癌死亡的患者约为49.8万，其中男性33.9万、女性15.9万[2]。相比之下，2012年世界范围内新发胃癌病例约95.1万，其中男性63.1万、女性32.0万；同期因胃癌致死患者约72.3万，其中男性46.9万、女性25.4万[3]。粗略统计可知世界新发胃癌的患者，一半以上位于我国，较为精确的流行病学研究显示，包括我国在内的东亚地区是胃癌的第一高发区,发病率约为24.6/10万人，其男性约35.4/10万人，女性约13.8/10万人，远高于世界平均发病率的7.5/10万人，其中男性约9.8/10万人、女性约5.1/10万人[3]。可见我国胃癌防治的严峻，因此更应深入研究胃癌的发病相关机制，寻找更为有效的诊断标记物及潜在的治疗靶点。

由于早期症状不典型，普查不及时，目前在我国早期胃癌的诊断率不足10%，有65%～70%的胃癌患者在就诊时已经达到中晚期，5年生存率较低，仅为27.4%，因此化疗和靶向治疗在胃癌治疗中起关键作用[4]。临床中胃癌除了诊断和鉴别诊断相关的免疫标志物外，还有如人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和MET原癌基因受体(MET proto-oncogene-receptor tyrosine kinase,MET)等治疗靶点相关标志物；虽然与胃癌患者化疗及预后相关的标志物有Ki-67、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complementing 1,ERCC1)等，但缺少统一的判读标准，且局限于蛋白表达水平[5]。因此，本课题组将尝试利用全基因组拷贝数变异(copy number variations,CNV)分析的方法，在癌症基因组图谱计划数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)中尝试鉴别出于胃癌患者化疗抵抗相关的基因。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集整理2008年1月到2013年12月在江门市中心医院就诊的胃癌患者信息，纳入标准：(1)有手术标本，采用改良的D2根治术；(2)有术后化疗记录，化疗周期不超过6个月；(3)有2年定期随访检查记录，能明确判断复发进展状况。共纳入64例胃癌患者，其中21例患者2年内的随访检查有复发进展状况，其余43例患者2年内无复发进展事件。TCGA与江门市中心医院胃癌患者的一般信息，见表1。

表1 TCGA及江门市中心医院胃癌患者的基本信息[n(%)]

1.2方法

1.2.1TCGA胃癌的全基因组CNV分析 参照文献[6]报道，利用开放软件TCGA简易下载工具V9.2(http://www.shengxin.ren/article/95)，下载TCGA中胃癌的基因组拷贝信息及对应样品的临床信息，数据库的更新下载日期为2018年5月31日，其中总病例数为443例，具有详细化疗药物使用信息的有135例，具有详细化疗药物使用信息和全基因拷贝信息的有121例，具有生存预后信息及全基因拷贝信息的有441例。参考文献[6-9]报道，在GenePattern公共服务器平台(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0软件分析全基因组拷贝信息。

1.2.2荧光定量PCR检测石蜡标本的基因组CNV 调取患者手术标本中肿瘤成分70%的石蜡组织，10 μm厚度切片4张。利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作说明书提取石蜡切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的荧光定量PCR引物Hs00585301_cn、Hs02658328_cn和Hs02774936_cn别检测ELP2、STAT3和SETD2基因组拷贝数，其中内参引物为TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍体参考样品为健康人血浆白膜层样品，扩增试剂盒为TaqMan Fast Advanced Master Mix，按说明书在CFX96荧光定量PCR仪中检测。参照文献[10]标准，规定样品中目标基因的相对拷贝数检测值小于0.75为缺失(Deletion)，>1.50为扩增(Gain)，其余为二倍体(Diploid)。

1.3统计学处理 采用Excel2010及GraphPadPrism 5.0软件处理数据，计数资料用频数表示，各组间频数数据统计使用χ2检验或Fisher′s精确检验，生存分析使用Kaplan-Meier分析方法及log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TCGA及江门市中心医院胃癌化疗用药情况分析 通过分析TCGA及江门市中心医院胃癌患者的临床用药信息，分别得到135例及64例患者记录了详细的化疗药物使用信息，其所用药物及分布，见表2，从表中数据可知氟尿嘧啶+铂类是胃癌患者最常用的化疗方案。在TCGA数据库的135例患者中，有81例治疗后呈完全缓解(complete response,CR)，3例为部分缓解(partial response,PR)，10例为病情稳定(stable disease,SD)，41例为病情进展(progressive disease,PD)。将呈CR的患者定义为化疗敏感(chemotherapy sensitivity,CS)，而PD的患者定义为化疗抵抗(chemotherapy resistant,CR)。在该院64例患者中，将21例患者2年内的随访检查有复发进展状况定义为CR，其余43例患者2年内无复发进展事件定义为CS。

2.2TCGA胃癌化疗反应相关的全基因组拷贝数分析 GISTIC 2.0分析显示，18q12.2和17q21.2区段特异性在化疗抵抗患者肿瘤组织中扩增，3p21.31区段特异性在化疗抵抗患者肿瘤组织中缺失，见图1、2。

表2 TCGA及江门市中心医院胃癌化疗用药情况

图2 胃癌肿瘤组织中全基因组缺失情况

2.3TCGA数据库中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV与化疗反应相关性 利用GISTIC 2.0软件明确18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因组CNV热点基因分别为乙酰基转移酶延伸因子复合物亚基2(elongator acetyltransferase complex subunit 2,ELP2)、信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和组蛋白甲基转移酶SETD2(histone-lysine n-methyltransferase 2,SETD2)；结果显示，ELP2和STAT3的扩增及SETD2的缺失均与胃癌化疗抵抗相关(P<0.05)。综合3个基因的CNV情况，可知CR患者中有其中1个指标阳性为24例，3个指标均阴性为17例；CS患者中，有其中1个指标阳性为17例，3个指标均阴性为63例，两组患者3个基因的分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 TCGA数据库中患者ELP2/STAT3/SETD2的基因拷贝数情况与化疗反应间相关性分析[n(%)]

表4 江门市中心医院患者ELP2/STAT3/SETD2的基因组拷贝数与化疗反应间相关性分析[n(%)]

2.4TCGA数据库中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV与患者预后相关性 利用TCGA数据库中患者的预后情况，以ELP2/STAT3/SETD2的基因组拷贝数作为分组，将患者分为3个指标任意1个指标阳性组(P组)及阴性组(N组)。阳性组患者的总生存时间(OS)、无进展生存时间(RFS)均明显短于阴性组(21.7、14.2个月vs. 34.8、17.9个月)，且两组患者生存曲线比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A：胃癌患者OS曲线；B：胃癌患者RFS曲线

图3 TCGA胃癌患者生存预后情况

2.5江门市中心医院患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV与化疗反应相关性 利用荧光定量PCR技术，检测64例患者肿瘤组织中ELP2/STAT3/SETD2的基因组拷贝数。结果显示，ELP2和STAT3的扩增及SETD2的缺失均与胃癌化疗抵抗相关(P<0.05)。综合3个基因的CNV情况，CR患者中1个指标阳性为14例，3个指标均阴性为7例；CS患者中1个指标阳性为9例，3个指标均阴性为34例，两组患者3个基因的分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

3 讨 论

本研究利用基因组CNV分析的方法，发现18q12.2区段、17q21.2区段在TCGA化疗抵抗样品中特异性扩增而3p21.31区段则缺失，并明确18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因组CNV热点基因分别为ELP2、STAT3和SETD2，进一步利用江门市中心医院的胃癌临床标本进行验证，明确了ELP2和STAT3的扩增及SETD2的缺失均与胃癌化疗抵抗明显相关(P<0.05)。

组蛋白修饰调控因子(如乙酰化和去乙酰化酶，甲基化和去甲基化酶等)是表观遗传调控的重要组成，其异常激活或失活经常导致人类的各种疾病尤其是癌症的发生。ELP2是延伸体(elongator)复合物的主要亚基，延伸体具有组蛋白乙酰转移酶活性，广泛参与了RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸、RNA修饰、细胞分裂、细胞骨架构建等细胞内关键调控过程，在真核生物中高度保守。有研究发现，ELP2具有两个七叶的含WD40结构域的 螺旋桨结构，并通过WD40折叠的完整性与ELP1和ELP3亚基结合，实现延伸体的装配，此外ELP2发生突变会明显影响延伸体的组蛋白H3乙酰化活性[11]，表明ELP2是延伸体行使功能的必要组分，也是复合体形成的枢纽。

虽然ELP2在癌症中的研究较少，但有研究发现，ELP2与STAT3有相互作用，参与了STAT3的转录调控及STAT3信号通路的转导[12]，而本研究发现，STAT3的扩增与胃癌的化疗抵抗明显相关(P<0.05)。国外有研究已经明确STAT3的激活在胃癌发生、发展中密切相关，抑制STAT3能增加化疗药物对胃癌细胞的杀伤[13]。虽然激活STAT3的信号通路很多，但是利用免疫组织化学检测判断STAT3激活状态的标准难以统一，而本研究发现，在胃癌化疗的患者肿瘤组织中，ELP2和STAT3在基因组水平就存在拷贝数扩增的情况。相比免疫组织化学评价STAT3的激活情况，利用原位杂交或PCR技术则更容易实践及统一标准，相关的研究会是本课题后续努力的方向。

除了ELP2介导的组蛋白H3乙酰化，组蛋白H3第36位赖氨酸(H3K36)还能够被多种甲基化酶修饰，其中SETD2能够在H3K36位点上产生三甲基化修饰(H3K36me3)，在转录延伸，RNA剪接和DNA损伤修复等过程中发挥关键调节作用[14]。近年来的研究发现，SETD2在结直肠癌[14]、胃肠道间质瘤[15]、透明细胞肾癌[16]等多种恶性肿瘤中起抑癌作用，而SETD2缺失可能通过改变极性蛋白2(dishevelled segment polarity protein 2,DVL2)转录时的内含子剪切过程，引起DVL2的mRNA降解，激活Wnt信号通路，促进了结直肠癌的癌变过程[14]。最近研究发现，胃癌组织中SETD2的表达下调，且SETD2的低表达与患者差的预后相关，过表达SETD2能抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭[17]，表明SETD2在胃癌中也是重要的抑癌基因。

虽然未见SETD2与ELP2及STAT3相互作用的报道，但是SETD2与ELP2同样属于组蛋白修饰调控因子，SETD2起甲基化修饰，而ELP2起乙酰化修饰。在基因转录的过程中，组蛋白的H3K36去甲基化及H3K27乙酰化的修饰，是转录启动的特征标志[18]，是否SETD2的缺失及ELP2的扩增对STAT3启动靶基因的转录调控起协调作用，这值得本课题组进一步探索。