COL4A1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响*

王译文，李 民，阿布都艾合提·买买提明，程方雄，罗少锋，何 峰，王必蓉

(1.武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属武汉普爱医院检验科，武汉 430077；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科，武汉 430022；3.武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属武汉普爱医院甲乳外科，武汉 430077)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内癌症相关致死率排名第2位的恶性肿瘤，每年大约有782 500例新发病例[1-2]。虽然手术、肝移植和射频消融等治疗手段可以延长患者的生存期，但其高复发率及远处转移最终导致患者预后不良[3]。因此，研究HCC的发生、发展及转移、侵袭的分子机制，对提高HCC的治疗水平具有重要意义。Ⅳ型胶原蛋白基因α1(collagen type Ⅳ alpha 1，COL4A1)是新近发现的一种原癌基因，其编码的血清Ⅳ型胶原α1链是基底膜的重要组成成分[4]。已有研究证实COL4A1在胃癌、结肠癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌及甲状腺乳头状癌中明显高表达，并与肿瘤细胞的增殖、分化和迁移密切相关[5-6]。然而，COL4A1在HCC中的表达及其功能国内外鲜有报道。本研究旨在阐明COL4A1在人HCC中的表达情况，并探讨其在HCC发生、发展中的作用，为HCC的诊断与治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2008年1月至2015年12月武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属武汉普爱医院手术切除的68例HCC组织标本，切取肝癌组织及其配对的癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm以上)，所有病例均经组织病理学诊断确认，所有患者术前均未接受放化疗及靶向治疗。新鲜离体标本均置于液氮中保存。本实验经该院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。在68例肝癌患者中，男51例，女17例，患者中位年龄为51岁；28例肿瘤直径大于或等于5 cm；Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期 15例。

1.2方法

1.2.1生物信息学 访问GEO数据集，下载HCC GSE14520数据，分析COL4A1 mRNA在HCC及癌旁组织表达差异性。

1.2.2COL4A1蛋白表达检测 取出组织并按80 mg/mL浓度加入裂解液裂解细胞，提取总蛋白。取得上清液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)测定蛋白水平。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用等体积的上样缓冲液加样，经过电泳后将蛋白电转至硝酸纤维素膜；室温封闭2 h，孵育稀释的一抗COL4A1(美国Santa Cruz公司)和β-actin(美国Thermo公司)，室温1 h后4 ℃过夜。洗膜后孵育稀释的二抗，室温2 h；洗膜后曝光检测。

1.2.3细胞培养与转染 培养人HCC细胞系HepG2，培养基选用DMEM(美国Gibco公司)，内含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素。将对数生长期的细胞接种于6孔板中，培养过夜待细胞贴壁即可转染。按照Lipofectamine 2000(美国invitrogen公司)转染试剂盒说明书上的步骤进行操作，转染后使用反转录PCR(RT-PCR)评估转染效果。

1.2.4细胞增殖试验 使用胰酶消化、重悬、调整细胞密度后加入96孔板，置于培养箱中培养；每孔加入CCK-8溶液(日本Dojindo公司)10 μL后，继续孵育1 h；将96孔板放入酶标仪中，在450 nm波长处读取吸光度值。检测细胞在第1～4天时的吸光度值，并绘制生长曲线。

1.2.5细胞迁移和侵袭试验 迁移试验步骤为：使用对数生长期的HepG2细胞，用胰酶消化、重悬、调整细胞密度后，加入Transwell小室，并加入无血清培养基100 μL；下室加入800 μL完全培养基。常规培养48 h后，取出Transwell小室，丢弃培养液，并用无菌棉签小心拭去上室底部的细胞，4%多聚甲醛固定细胞20 min，0.1%结晶紫染色15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后将Trasnwell小室置于显微镜下观察计数。侵袭试验与迁移试验基本相同，不同点为侵袭实验使用滤膜附有Matrigel的Transwell小室。

2 结 果

2.1生物信息学 通过统计学分析GSE14520数据库，结果显示HCC组织COL4A1 mRNA表达水平明显高于配对癌旁组织(P<0.01)，见图1。

图1 COL4A1 mRNA在HCC组织及癌旁组织表达水平

2.2COL4A1在HCC组织和癌旁组织中的表达 COL4A1在HCC组织中的表达水平为0.912±0.153，明显高于癌旁组织的0.725±0.138，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 Western blot检测COL4A1在HCC组织(T)及癌旁组织(N)中的表达

2.3COL4A1表达水平与临床特征的关系 按COL4A1表达水平高低将患者排序，并分为高表达组和低表达组各34例，分析COL4A1表达与患者临床特征的关系。结果显示，COL4A1的表达水平与肿瘤分期明显相关，高COL4A1表达患者TNM分期高(P<0.05)，见表1。

表1 COL4A1表达与HCC患者临床特征的关系 [n(%),n=34]

续表1 COL4A1表达与HCC患者临床特征的关系 [n(%),n=34]

2.4敲低COL4A1后对HCC细胞增殖能力的影响 敲低COL4A1可明显抑制HepG2细胞的增殖能力，且抑制作用随着作用时间的延长而增加(P<0.01)，见图3。

图3 CCK-8试验检测敲低COL4A1对HepG2细胞增殖的影响

2.5敲低COL4A1后对HCC细胞迁移能力的影响 敲低COL4A1可明显降低HepG2细胞的迁移能力(P<0.01)，见图4。

A：对照组(×200);B:COL4A1敲低组(×200)；C:迁移实验统计图;a:P<0.01,与对照组比较

图4两组HCC细胞迁移能力比较

2.6敲低COL4A1后对HCC细胞侵袭能力的影响 敲低COL4A1可明显降低HepG2细胞的侵袭能力(P<0.05)，见图5。

A:对照组(×200)；B:COL4A1敲低组(×200)；C:侵袭实验统计图;a:P<0.05,与对照组比较

图5两组HCC细胞侵袭能力比较

3 讨 论

HCC是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、进展迅速、预后差，严重地威胁着人类的健康。由于HCC起病隐匿，大多数患者就诊时因早期浸润生长并发远处转移而失去根治性手术机会，此外癌细胞的迁移和侵袭是HCC治疗失败和复发的重要原因。因此，研究HCC细胞的迁移和侵袭能力，对于后续探索HCC发生、发展的分子机制及降低HCC细胞转移风险具有重要意义。

COL4A1蛋白由氨基末端7S结构域、三螺旋形成胶原结构域和羧基末端非胶原结构域共同组成，并与其他细胞外基质成分，如基底膜蛋白多糖、蛋白聚糖及层连蛋白相互作用[7]。COL4A1的羧基末端非胶原结构域经过溶蛋白性裂解生成具有生物活性片段，在血管生成和肿瘤发展过程中发挥重要作用，其表达受趋化因子受体7(CXCR7)及其下游的磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、核因子-κB(NK-κB)调节[7-8]。此外，COL4A1基因的突变与脑出血、遗传性血管病、肾病、动脉瘤及肌肉痉挛等密切相关[9]。MIYAKE等[10]研究发现，膀胱尿路上皮癌细胞可通过产生COL4A1与COL13A1，激活细胞内的AKT信号通路，使E-cadherin转换为N-cadherin，从而增加癌细胞的侵袭能力。SALEM等[11]发现COL4A1在乳腺癌中亦高表达，且在体外试验中过表达COL4A1可促进乳腺癌细胞增殖及迁移；敲低其表达可明显降低癌细胞存活率并导致癌细胞细胞周期停滞。另有研究证实，在乳腺癌发生及发展中COL4A1的表达与P4HA2的表达密切相关；异常高表达的P4HA2可通过上调下游COL4A1的表达促进肿瘤细胞增殖及转移[12]。此外，亦有研究报道COL4A1是头颈部鳞状细胞癌[13]、甲状腺乳头状癌[14]潜在治疗的靶基因。

近期研究证实，COL4A1亦在消化道恶性肿瘤中有重要意义。曲妥珠单抗是针对人表皮生长因子受体2(HER2)的靶向抗体，用于治疗HER2过表达的胃癌患者。HUANG等[5]研究发现,COL4A1在胃癌组织和曲妥珠单抗胃癌细胞中高表达，COL4A1可能赋予胃癌对曲妥珠单抗的耐药性。此外，COL4A1被证实可作为肝内胆管细胞癌的诊断标志物[15]。迄今尚未有关于COL4A1的表达与HCC发生、发展相关的研究报道。本课题组通过分析HCC数据库及检测临床配对HCC标本，首次发现COL4A1在HCC组织中明显高表达，且其表达水平与TNM分期相关，高COL4A1表达患者TNM分期高。随后本课题组通过细胞增殖、迁移及侵袭等体外实验证实，敲低COL4A1表达可明显降低HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。据此，本课题推测COL4A1可能在HCC细胞的增殖、迁移及侵袭中发挥重要作用。

综上所述，本课题组首次提出COL4A1可能是肝细胞癌的潜在癌基因，并可能通过影响肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭参与HCC的发生、发展。COL4A1可能作为HCC诊断和治疗的新的生物靶点。本课题组拟后续深入探讨COL4A1参与HCC发生、发展的具体信号通路，为COL4A1的靶向治疗提供理论基础。