壮医药线点灸对糖尿病性胃轻瘫大鼠脑肠肽Ghrelin、CCK的影响*

张 勇，李蓓蕾，梁修朗，唐莫玲，黄梓健，范郁山

(1.广西中医药大学研究生院，南宁 530001；2.广西中医药大学针灸推拿学院，南宁 530001)

糖尿病性胃轻瘫(diabetic gastro paresis，DGP)是以胃动力障碍、胃排空延迟为主要特征的糖尿病常见慢性并发症之一，超过50%的患者出现餐后饱胀感、反流、上腹不适、恶心、呕吐、厌食等，严重影响生活质量[1-2]。DGP发病机制多认为与胃肠激素紊乱、Cajal间质细胞病变、自主神经病变有关[3]。胃肠激素是调控胃肠运动的重要因素，近年来有关胃肠激素研究逐渐增多，有代表意义的是促生长素(Ghrelin)和胆囊收缩素(CCK)[4]。脑肠肽是同时存在于胃肠道和大脑的胃肠激素或神经肽，对胃肠道运动、感觉和分泌功能具有调控作用。Ghrelin又称胃饥饿素，是一种促进食欲的脑肠肽，是生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体，能够促进生长激素(GH)分泌、增加食欲、促进摄食及胃肠运动[5]。CCK是由十二指肠I细胞分泌的广泛分布于中枢神经系统和胃肠道的胃肠激素，作为经典脑肠肽的一员，可以通过诱发中枢饱感信号、减少摄食行为和胃肠运动而抑制食欲[6-7]。目前临床治疗DGP常用促胃动力药物以缓解症状，但远期疗效不佳，不良反应较多，且易产生耐药性，寻找安全有效的防治方法具有重要的临床意义[8]。近年来开展了大量的针刺治疗DGP的研究，证实了针刺能有效治疗DGP[9]，而有关灸法的研究较少报道，壮医药线点灸疗法的研究尚处于起步阶段，缺乏基础研究和机制研究[10]。本实验拟从食欲兴奋剂Ghrelin和食欲抑制剂CCK这一对互相拮抗的脑肠肽作为研究的切入点，观察壮医药线点灸对DGP大鼠的影响，探讨壮医药线点灸治疗DGP的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 80只6周龄清洁级SD大鼠,体质量(231±10)g，雌雄各半，购于长沙天勤生物公司[SCXK(湘)2014-0011]，所有大鼠均为同一批次，且一般体检无异常。大鼠自由饮食摄水，分笼饲养于室温(22±2)℃，湿度50%～60%，12 h间断光照的动物房。普通饲料和高脂饲料(蔗糖20%、猪油15%、奶粉5%、鸡蛋2%、鼠维持饲料58%)，由沈阳市前民动物实验饲料厂提供。

1.1.2主要试剂和仪器 链脲佐菌素(STZ,美国Sigma)；甲氧氯普胺片(山西云鹏制药)；酚红(天津光复精细化工)；大鼠Ghrelin、CCK ELISA试剂盒(南京建成生物工程)；Ghrelin兔抗多克隆抗体(英国Abcam)；血糖仪及血糖试纸(美国强生OneTouch)；TGL-18R台式离心机(珠海黑马)；DYY-12电泳仪、DYCZ-40AZ转膜仪(北京六一)；AX-X射线摄影暗匣(广东粤华)；酶标仪(美国Thermo)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津)。

1.2方法

1.2.1实验分组 通过随机数字表法将80只SD大鼠分为空白组20只和造模组60只，每组雌雄各半。将造模成功后的60只DGP大鼠再次随机分成模型组、甲氧氯普胺组、壮医药线点灸组，每组20只。

1.2.2DGP大鼠模型建立 空白组大鼠给予普通饲料，造模组大鼠给予高脂高糖饲料喂养8周；第9周，造模组大鼠予2%STZ溶液(55 mg/kg)一次性腹腔注射破坏胰岛细胞，并于注射后12、24、72 h采集鼠尾静脉血测血糖值，选择空腹血糖(FGB)≥16.65 mmol/L的成模大鼠纳入实验[11]。

1.2.3实验方法 空白组、模型组灌胃同体积0.9%氯化钠溶液；甲氧氯普胺组灌胃同体积1.7%甲氧氯普胺溶液，连续15 d，每次用药体积按100 g体质量1 mL换算，实验期间各组大鼠予普通饲料自由进食、饮水。壮医药线点灸组：选取直径0.7 mm的2号线(由广西中医药大学第一附属医院提供)统一采用重手法点灸，点灸方法参考《壮医药线点灸学》[12]按持线-点火-施灸步骤操作，每穴点灸3壮(线头火星对准穴位，一按火灭即起为1壮)，连续15 d。施灸处方：“中脘”“内关”“足三里”“脾俞”“胃俞”均为双侧；取穴方法参考李忠仁[13]制订的“动物针灸穴位图谱”及解剖学定位。

1.2.4样品制备和指标检测 各组大鼠治疗15 d后，禁食24 h、禁水2 h，采集大鼠尾静脉血测FBG水平，然后用2 mL酚红溶液(0.5 mg/mL)灌胃，30 min后以10%水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔经腹主动脉采血，以3 000 r/min离心10 min后取上清液，ELISA法检测血清Ghrelin水平。采血结束后，结扎贲门和幽门，取出大鼠全胃，冲洗胃内容物，定容20 mL，加入0.5 mol/L氢氧化钠20 mL静置取上清液，再加入20%三氯乙酸去除蛋白，离心取上清液在560 nm波长紫外分光光度计下检测吸光度值(OD)。用镊子轻轻取出上至幽门、下至回盲瓣的小肠管并将小肠拉直铺于白纸上，用直尺测量幽门到酚红染成红色末端距离(a)及幽门到回盲瓣全长(A)，取二者之比值即为小肠推进率。测量结束后，从大鼠全胃中剪取小段胃大弯组织，剪碎加PBS制成组织匀浆液，经研磨、离心、取上清液，用ELISA法检测胃窦CCK水平；另剪取小段胃窦组织置于冻存管，保存在-80 ℃冰箱备用。胃排空率计算公式如下：

胃排空率=(1-实测酚红OD值/标准酚红OD值)×100%。

1.2.5Western blot检测胃窦组织Ghrelin的表达水平 取出冻存的胃窦组织，加入RIPA裂解液充分裂解、匀浆、离心提取蛋白，并进行电泳、湿转膜，分别加入一抗、二抗，ECL发光液显色后将膜置于发光体系中检测、显影冲洗保存，以目的条带和β-actin条带灰度值比值进行相对定量分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖水平比较 造模后与空白组比较，模型组、壮医药线点灸组、甲氧氯普胺组大鼠血糖水平明显升高(P<0.01);与同组造模前比较，血糖水平也明显升高(P<0.01)。经15 d治疗后，壮医药线点灸组与模型组相比，血糖水平明显下降(P<0.01)，且与本组造模后相比，血糖水平也明显下降(P<0.01)；而甲氧氯普胺组与模型组血糖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

a：P<0.01，与造模前比较；b：P<0.01，与空白组比较；c：P<0.01，与壮医药线点灸组比较；d：P<0.01，与本组造模后比较

2.2各组大鼠胃排空率与小肠推进率比较 与空白组比较，模型组大鼠的胃排空率及小肠推进率明显降低(P<0.01)；与模型组比较，壮医药线点灸组、甲氧氯普胺组大鼠胃排空率及小肠推进率明显增强 (P<0.01)；而壮医药线点灸组与甲氧氯普胺组大鼠胃排空率及小肠推进率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.01，与模型组比较

2.3各组大鼠Ghrelin、CCK水平比较 与空白组比较，模型组大鼠血清Ghrelin水平明显减少(P<0.01)，胃窦CCK水平明显增加(P<0.01)；与模型组比较，壮医药线点灸组大鼠血清Ghrelin水平明显增加(P<0.01)，胃窦CCK水平明显降低(P<0.01)；与甲氧氯普胺组比较，壮医药线点灸组大鼠血清Ghrelin水平增加(P<0.05)，胃窦CCK水平降低(P<0.05)，见图3、4。

2.4各组大鼠胃窦组织Ghrelin蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织Ghrelin蛋白表达明显降低 (P<0.05)；与模型组比较，壮医药线点灸组大鼠胃窦组织Ghrelin蛋白表达明显上升(P<0.05)；甲氧氯普胺组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.01，与模型组比较；c：P<0.05，与甲氧氯普胺组比较

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.01，与模型组比较；c：P<0.05，与甲氧氯普胺组比较

A空白组，B模型组，C壮医药线点灸组，D甲氧氯普胺组。a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较

3 讨 论

近年来，随着生活水平的提高、饮食结构的改变，糖尿病的发病率在世界范围内快速增长，已成为继心血管病和肿瘤之外的第三大非传染性疾病。DGP是糖尿病最常见的胃肠道并发症，不仅会引起顽固性呕吐、厌食、营养不良，而且影响口服药物吸收变化，造成血糖难以控制，甚至造成餐后低血糖危险、电解质紊乱、难治性糖尿病的发生[14]。DGP归属于壮医学理论的“谷道病”范畴，其病机是谷道虚损、毒邪阻滞“龙路”、“火路”气机、“巧坞”淤滞，其根本治法是调气补虚解毒[10]。“足三里”是胃之下合穴，“合治内腑”，擅长治疗胃肠系统疾患；“内关”是止呕要穴，有和中降逆，消积导滞之效；“脾俞、胃俞”是脾胃二脏的背俞穴，可外散水湿于膀胱经，内调脾胃之气，与胃俞募穴、“腑会”中脘穴“俞募配穴”，一阴一阳，可使清阳上升、浊阴下降，恢复脾胃气机升降。有研究表明，使用上述5穴均能增强胃动力，改善胃肠功能[15-16]。通过独特壮药浸泡的壮医药线点灸以上诸穴，既能发挥针灸疏通经络、健脾和胃的作用，又能调气补虚、化食解毒，使“壮医三气”复归同步。

DGP发生的本质是胃肠功能的紊乱，表现在消化间期推进性复合波(MMC)Ⅲ期消失，餐后胃、十二指肠收缩不协调，幽门括约肌痉挛，胃排空异常[3]；而脑肠肽通过迷走神经介导，可以在中枢和外周途径上对胃运动和胃排空进行精细调节，对胃肠功能的调节起重要调控作用[4,17]。Ghrelin是第一种被证明能刺激进食的循环激素，具有诱发MMCⅢ期收缩、提高胃窦幽门协调运动、促进胃肠蠕动的作用，通过与其受体GHSR结合后在中枢和外周途径发挥作用[18]。在大脑中，Ghrelin与受体GHSR结合后激活下丘脑弓状核(Arc)-外侧隔核Ghrelin神经通路[19]、海马CA1区-下丘脑Arc Ghrelin神经通路[20]，下丘脑外侧区-延髓迷走神经复合体-迷走神经轴等多个中枢神经核团，并最终激活神经肽Y/刺鼠色蛋白相关蛋白神经元(NPY/AGRP)[21]，上调胃牵张敏感神经元放电活动[22]，从而介导胃肠运动和多食行为；并且Ghrelin受体阻滞剂(D-Lys3-GHRP-6)可完全阻断上述神经通路的激活及胃牵张敏感神经元放电效应[23]。在外周途径中，Ghrelin通过与分布在肌间神经丛、黏膜下神经丛、迷走神经传入纤维上的GHSR受体结合促进胃酸分泌和胃肠蠕动，协调胃窦、幽门与十二指肠运动，此过程可被阿托品和迷走神经切断术所阻断[24]。

CCK作为一种经典的脑肠肽，不仅参与胃肠功能的调节，同时对中枢神经系统饱感信号产生、食欲调节方面有着重要作用[25]。在大脑中，CCK作为一种饱感信号，通过激活“下丘脑背内侧核(DMH)CCK-NPY”信号通路，上调下丘脑室旁核(PVN) 促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)基因表达，抑制Arc NPY表达，激活外周饱感传入枢纽阿片黑色神经元(POMC)，发挥控制摄食和能量代谢平衡作用[26-27]；而对CCK受体基因先天缺失(OLETF)大鼠的研究也表明，CCK受体缺失引起DMH NPY高度表达促进了OLETF大鼠肥胖和糖尿病形成[28]。外周途径中，CCK一方面与分布在胃窦、幽门、小肠黏膜上及肠道分支迷走传入神经上的受体结合，松弛近端胃窦、增加胃的顺应性，提高幽门括约肌紧张度，抑制胃窦和近端十二指肠蠕动，从而延缓胃排空；另一方面，通过促进胆囊收缩和胰腺分泌，提高胰酶活性，有助于脂肪和蛋白的消化吸收，从而抑制进食；并且生理或药物剂量的CCK均能抑制进食后的胃排空[7,29]。

有临床实验发现，DGP患者往往伴随着脑肠肽Ghrelin和CCK紊乱，而静脉注射Ghrelin激动剂能明显改善DGP患者食欲缺乏，对于结肠部分切除术后肠梗阻也有良好的治疗效果[30]；此外，静脉注射CCK能减少肥胖患者摄食量，基于CCK的方法可治疗肥胖[31]。相关实验证明，电针足三里等穴可上调胃窦部Ghrelin、GHSR mRNA表达，降低胃窦CCK水平[3,32]。本研究结果显示，胃肠运动功能下降与胃窦部Ghrelin和CCK分泌紊乱、Ghrelin蛋白表达下降相关，与上述研究结果一致。并且，经壮医药线点灸干预后，壮医药线点灸组大鼠胃排空率和小肠推进率提高，胃窦Ghrelin水平及蛋白表达水平增加，胃窦CCK水平下降，提示壮医药线点灸“中脘”等穴改善胃运动的机制可能是上调血清Ghrelin水平并下调胃窦CCK水平，促进Ghrelin在胃窦部蛋白表达，通过中枢和外周途径调节脑肠肽分泌紊乱状态。然而，这一过程涉及到的机制十分复杂，尚有待后续进一步研究。