大鲵皮肤色素提取工艺及抗氧化研究

杨 慧，陈德经,2*，夏冬辉，韩 豪,2，陈海涛

1陕西理工大学生物科学与工程学院；2陕西理工大学，陕西省资源生物重点实验室；3陕西理工大学化学与环境科学学院；4汉中龙鲵生物工程股份有限公司，汉中 723001

大鲵(Andriasdavidianus)俗称“娃娃鱼”，属有尾目、隐鳃鲵科，是鱼类和爬行动物之间的代表两栖类过渡类型，有“生物界活化石”的美称[1]，其机体中含有多种天然活性物质，在药用、保健产品的开发利用方面具有独特的经济价值[2]。近年来，人们对大鲵研究主要集中在大鲵肉[3]和大鲵黏液[4]等方面，尚未对大鲵皮肤黑色素开展相关研究。黑色素是酚类或吲哚类物质通过氧化聚合形成的高分子生物色素，其不溶于水、酸和常见的有机溶剂，可溶于氢氧化钠、三乙胺等碱性溶液[5]。动物黑色素有真黑色素和脱黑色素两类，前者不含硫，呈棕色或黑色；后者含硫，呈黄色或微红棕色。天然黑色素具抗紫外、抗氧化、抗菌、提高免疫力[6-9]功效，可应用于化妆品、天然染发剂、食品添加剂和药品等领域。

目前，动物黑色素的提取方法主要有高速离心法[10]、酸/碱水解法[11]、酶法[12]和碱溶酸沉法[13]。提取和制备方法的不同会对黑色素结构和生物活性产生不同程度的影响，要获得高纯度的黑色素，就要最大限度的去除色素以外的其它物质。酶解可去除蛋白质，碱溶酸沉可去除黑色素中其它不被酶解的杂质，得到纯度较高的色素。

本实验利用酶法和碱溶酸沉法制备大鲵皮肤黑色素，以大鲵皮黑色素的提取率为指标，在单因素实验基础上，用正交实验优化黑色素提取的工艺条件。利用紫外-可见光谱仪、红外光谱仪和超高效液相-三重四级杆串联质谱仪测定大鲵皮肤黑色素的组成成分，并测定其抗氧化性，为大鲵皮黑色素的综合开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：大鲵皮，汉中龙鲵生物工程股份有限公司提供。

试剂：维生素C，GR(天津市天新精细化工开发中心)；三乙胺，GR(天津市富宇精细化工开发中心)；硫酸亚铁、水杨酸，GR(天津市北联精细化学品开发有限公司)；邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷，GR(上海源叶生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶，酶活力1000 U/mg(北京鼎国生物技术有限责任公司)；溴化钾，色谱纯(天津天光光学仪器有限公司)；甲醇、甲酸，色谱纯(天津市光复科技发展有限公司)。

仪器：UPLC-TQD超高效液相-三重四级杆串联质谱仪(Waters)；BRUKER VERTEX 70 红外光谱仪(德国布鲁克有限公司)；UV-1750 型紫外可见分光光度仪(日本岛津仪器公司)；LC-800低速离心机(科大创新股份有限公司)；JA5003电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；601超级水浴锅(金坛市瑞华仪有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鲵皮肤色素提取及纯化工艺

将大鲵皮置于6%NaCl中浸泡60 min后转入0.1%柠檬酸溶液中脱色，45 ℃水浴90 min后刮取色素，而后加入5%木瓜蛋白酶，55 ℃酶解4 h后离心，弃上清液。用石油醚反复溶解沉淀物3次以除去色素中的脂肪，抽滤后真空干燥沉淀物。然后称取沉淀物，加入氢氧化钠溶液浸提一段时间后，离心，取上清液，用6 mol/L HCl溶液调pH至1.0，静置后4 000 rpm离心10 min，所得沉淀物即为黑色素粗提物。将黑色素粗提物按以上碱溶、酸沉步骤反复进行3次后，用乙醇、蒸馏水洗涤后，40 ℃真空干燥即得大鲵黑色素纯品，计算提取率。

提取率=黑色素纯品质量/刮取色素质量×100%

1.2.2 单因素实验

准确称取大鲵皮色素1 g，设定氢氧化钠浓度6%、料液比1∶15、提取温度45 ℃为固定值，分别考察不同氢氧化钠浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)和提取温度(35、40、45、50、55 ℃)对大鲵皮肤黑色素提取率的影响，提取时间均为30min。

1.2.3 正交实验

在单因素实验基础上，进行L9(34)正交实验，以大鲵皮肤黑色素提取率为指标，确定最佳工艺条件。实验方案见表1。

表1 正交因素水平设计表

1.2.4 大鲵皮色素定性分析

1.2.4.1 紫外-可见光谱法

取大鲵皮色素于0.01%氢氧化钠溶液中，震荡混匀后置于超声清洗器中超声30 min，制得大鲵皮色素溶液。紫外可见分光光度计测定200～800 nm大鲵皮色素溶液的吸光值，绘制吸光值随波长变化的曲线图。

1.2.4.2 红外光谱法

溴化钾压片法：将烘干的溴化钾置于玛瑙钵体中研成细粉，准确称取150 mg溴化钾粉末两份，一份与1 mg纯化后色素样品研细混匀，另一份作为空白，分别压片。用红外光谱仪测定4 000～400 cm-1区间内的透过率。

1.2.4.3 UPLC-MS/MS法

样品制备：取纯化的大鲵皮黑色素10 mg溶解于1%三乙胺-50%甲醇混合溶液中，用混合液定容至25 mL，然后过0.45 μm有机滤膜，用UPLC-MS/MS测定。

色谱条件：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速：0.8 mL/min；柱温40 ℃；进样量：10 μL。流动相甲醇和1%甲酸水溶液(两者体积比5∶95)；检测波长270 nm。

质谱条件：MS扫描；电离模式：ESI扫描方式，负离子扫描；脱溶剂气流：600 L/h；脱溶剂气温度：400 ℃；锥孔电压：30 V；离子源温度：110 ℃；毛细管电压：3 KV。

1.2.5 大鲵皮色素抗氧化性

1.2.5.1 清除超氧阴离子自由基

取不同质量浓度的样品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)4.5 mL，在25 ℃水浴10 min后，加入3 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL混匀，在25 ℃水浴5 min，最后加入8 mmol/L HCl终止反应，在波长299 nm处测定其吸光度值，以4% NaOH溶液调零，维生素C为阳性对照，平行测定吸光度值3次。按下式计算超氧阴离子自由基清除率。

式中：A0为不加样品溶液，加入邻苯三酚的溶液吸光度；A1为加入样品溶液和邻苯三酚的溶液吸光度；A2为加入样品溶液但不加邻苯三酚的溶液吸光度。

1.2.5.2 清除羟基自由基

向试管中加入不同质量浓度的样品溶液2 mL，9 mmol/L硫酸亚铁2 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，最后加入9 mmol/L双氧水2 mL启动反应，震荡混匀，37 ℃水浴保温30 min，冷却至室温后离心(5 000 rpm，10 min)，取上清液在波长510 nm处每隔30 s测定其吸光度值，以4% NaOH溶液调零，维生素C为阳性对照，平行测定吸光度值 3 次。按下式计算羟自由基的清除率。

式中：A0为不加样品溶液，加入水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度；A1为加入样品溶液和水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度；A2为加入样品溶液但不加水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度。

1.3 数据分析

用SPSS软件进行数据分析，用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 氢氧化钠浓度对提取率的影响

氢氧化钠浓度对大鲵皮肤黑色素提取率的影响见图1。由图 1 可知，随着NaOH浓度的增大，黑色素的提取率逐渐升高，当浓度为1.5 mol/L时，提取率最高为0.93%。再增加NaOH浓度，黑色素的提取率开始降低，可能是因为氢氧化钠浓度越大，碱溶性杂质溶解量会增加，影响了大鲵皮黑色素在酸沉过程的析出，导致其提取率降低。因此，单因素确定氢氧化钠的最适浓度为1.5 mol/L。

图1 NaOH浓度对大鲵皮肤黑色素提取率的影响Fig.1 Effect of NaOH concentration on melanin extraction rate of giant salamander skin

图2 料液比对大鲵皮肤黑色素提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid on melanin extraction rate of giant salamander skin

2.1.2 料液比对提取率的影响

料液比对大鲵皮肤黑色素提取率的影响见图2。由图 2 可知，随着料液比的增加，大鲵皮肤黑色素的提取率呈现先升高后降低趋势。这是因为随着料液比的增加，内外浓度差增大，传质动力加大，提取率也随之增大。当料液比达到1∶15时，提取率最大为0.97%。再增加料液比，其它碱溶性杂质的溶解度增加，提取率降低。因此，单因素确定最适料液比为1∶15。

2.1.3 提取温度对提取率的影响

提取温度对大鲵皮肤黑色素提取率的影响见图3。由图3可知，随着温度升高，提取率先升高后降低，温度为45 ℃时提取率最高为0.95%，继续升温至55 ℃，提取率降至0.29%。这可能是温度升高可增大分子扩散系数，有利于提取率的提高。温度持续升高，碱溶性杂质溶解度增加，黑色素结构可能破坏，提取率降低。因此，单因素确定最适温度为45 ℃。

2.2 正交实验结果

在单因素实验的基础上，选取氢氧化钠浓度、液料比、提取温度进行3因素3水平的正交实验，实验方案及结果见表2。由表2中R值大小可以看出，各因素影响大小为C(温度)>A(氢氧化钠浓度)>B(料液比)，理论上以A2B2C1为最优组合。对正交试验进行了表3的方差分析，发现A、B、C因素对提取工艺均无显著性影响(P>0.05)。综合成本及能耗因素，最终确定大鲵皮肤黑色素提取的最佳工艺为A2B2C1，即在氢氧化钠浓度为1.5 mol/L，反应温度45 ℃，料液比1∶15 g/mL条件下提取，提取率为0.65%。

图3 提取温度对大鲵皮肤黑色素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on melanin extraction rate of giant salamander skin

表2 正交实验结果

2.3 大鲵皮色素定性分析结果

2.3.1 UV-VIS光谱谱图

大鲵皮色素的红外光谱图如图4所示，黑色素多聚物因其高度的共轭效应而产生广谱的光吸收特性。大鲵皮黑色素在紫外区的最大吸收波长为214 nm，在可见光区没有特征吸收峰，在200～400 nm波长范围内吸收值随波长的增大而减少。这与报道的不同来源动物黑色素的最大吸收波长在210 nm左右一致。宋茹等[14]用酶解法制备的鱿鱼黑色素在220 nm有特征吸收峰。衡惠等[15]用碱溶酸沉法提取的黑蚂蚁黑色素的最大吸收峰在212 nm处。

表3 方差分析

注：F0.05(1,2)=19。

Note:F0.05(1,2)=19.

图4 大鲵皮色素的紫外-可见光谱图Fig.4 Ultraviolet visible spectrum of giant salamander skin pigment

2.3.2 红外光谱谱图

红外光谱是一种化合物结构鉴定的有效方法，有关天然和合成黑色素的研究[16]表明，黑色素的红外光谱大体可归属为3 200～3 500 cm-1为吲哚和吡咯结构单元中N-H和O-H的伸缩；2 950～2 980 cm-1为烷基中的C-H的伸缩；1 710 cm-1为羧基中C=O伸缩振动；1 610～1 690 cm-1为芳香环中C=C和C=N的弯曲以及C=O伸缩(酰胺)；1 250～1 468 cm-1为酚羟基和羧羟基；1 100～1 050 cm-1为氨基酸中的醇羟基O-H振动；700～600 cm-1为C-S单键的伸缩振动。

由图5可知大鲵皮黑色素结构信息如下，N-H 伸缩振动 (3 296 cm-1)，氨基酸中脂肪族C-H伸缩振动 (2 858 cm-1、2 931 cm-1)，酰胺C=O伸缩振动 (1 653 cm-1)，黑色素吲哚环和氨基酸中N-H的弯曲振动(1 543 cm-1)，氨基酸中脂肪族C-C弯曲振动(1 455 cm-1)，氨基酸中C-N伸缩振动(1 377 cm-1)，酚羟基伸缩振动(1 236 cm-1)，C-O伸缩振动(1 060 cm-1)，C-S伸缩振动 (617 cm-1)。1653 cm-1处的强吸收峰推测其有黑色素典型的苯醌类结构，3 296 cm-1和1 543 cm-1处的吸收峰推测有吲哚结构，617 cm-1推测其可能含硫元素。与乌鸡黑色素的红外光谱相比[17]，主要特征吸收峰位置非常接近，说明大鲵皮黑色素与乌鸡黑色素的主要功能基团基本一致。

图5 大鲵皮色素的红外光谱图Fig.5 Infrared spectrum of giant salamander skin pigment

2.3.3 UPLC-MS/MS谱图

黑色素的基本结构是一些共价交联的吲哚环，同时含有不定量的吲哚合成前体物。动物黑色素细胞主要产生真黑色素和脱黑色素。真黑色素是由5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)黑色素和5,6-二羟基吲哚(DHI)黑色素聚合而成，脱黑色素是由2-S-半胱氨酸和5-S-半胱氨酸聚合脱羧形成的苯丙噻嗪衍生物。由图6可知，采用1%三乙胺-50%甲醇混合溶液溶解后，三乙胺将大鲵黑色素氧化，通过色谱柱分离后得到图3C两个色谱峰，保留时间分别为0.90和2.15 min。采用MS扫描后，可得准分子离子峰分别为m/z258和m/z283，结合真黑色素和脱黑色素的降解过程及降解产物可知[18]，化合物A相对分子质量为257，名称为5-(羧(羟)基)-4-(羧羰基)-1H-吡咯-2-羧酸，为真黑色素的降解过程产物之一；化合物B相对分子质量为282，名称为6-(2-氨基-2-羧乙基)-2-羧基-4-羟基苯并噻唑 (BTCA)，为脱黑色素的降解产物之一，对应化合物的结构式分别如图7A、B 所示。初步可知，大鲵皮肤色素由真黑色素和脱黑色素两种色素组成。

有研究表明乌贼黑色素几乎为纯净的真黑色素，含有75%的DHICA和20%的DHI[19]，其余5%为结合蛋白[20]。孙亚真[21]利用高相液相色谱及质谱对乌骨鸡黑色素进行分析，认为乌骨鸡黑色素为真黑色素。Borges等[22]对人体头发黑色素的研究表明，头发黑色素既有真黑色素，也有脱黑色素。由此可见，不同生物、不同组织中黑色素的组成随物种的差异而不同。

图6 大鲵皮色素的UPLC-MS/MS谱图Fig.6 UPLC-MS/MS spectrum of giant salamander skin pigment注：图6A为化合物A 质谱图，图6B为化合物B质谱图，图6C为大鲵皮色素全扫描总离子流图。Note:Fig.6A is compound A mass spectrogram,Fig.6B is compound B mass spectrogram,Fig.6C is total ion flow diagram ofgiant salamander.skin pigments.

图7 大鲵皮色素的化学结构式Fig.7 Chemical structure of giant salamander skin pigment注：图7A为化合物A名称【6-(2-氨基-2-羧乙基)-2-羧基-4-羟基苯并噻唑】。图7B为化合物B名称【5-(羧(羟)基)-4-(羧羰基)-1H-吡咯-2-羧酸】。Note:Fig.7A is the name of compound A [(6-(2-amino-2-carboxyethyl)-2-carboxylic acid-4-hydroxybenzo[d]thiazole].Fig.7B is the name of compound B [5-(carboxy(hydroxy)methyl)-4-(carboxycarbonyl)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid].

2.4 大鲵皮肤色素抗氧化性

2.4.1 超氧自由基清除能力

大鲵皮色素对超氧阴离子自由基的清除作用如图8所示，从图8可以看出，在实验设置的质量浓度范围内大鲵皮色素对超氧自由基均有一定的清除作用，其清除能力与质量浓度成正比。当浓度在2.5 mg/mL时，大鲵皮色素对超氧阴离子自由基的清除率为30.51%，而VC对超氧自由基的清除能力较强，在浓度2 mg/mL时清除率就已超过90%。

图8 大鲵皮肤色素对超氧阴离子自由基清除率曲线Fig.8 Clearance curves for giant salamander skin pigment to superoxide free radicals

2.4.2 羟基自由基清除能力

大鲵皮色素对羟基自由基的清除作用如图9所示：由图9可知，大鲵皮色素在实验设置的质量浓度范围内对羟自由基的清除作用随浓度的增大而增强，但清除作用均低于VC。在浓度为0.5～2.0 mg/mL时，随浓度的增加，大鲵皮色素对羟自由基的清除率显著升高，但当浓度高于2 mg/mL时，随浓度的增加，清除率趋于稳定。浓度在2.5 mg/mL时，大鲵皮色素对羟基自由基的清除率为54.17%，而VC在1.5 mg/mL时清除率达到93%以上。

图9 大鲵皮肤色素对羟基自由基清除率曲线Fig.9 Scavengingcurves for giant salamanderskin pigment to hydroxyl radicals

吴世玉等[23]研究了林蛙卵黑色素的抗氧化性，表明林蛙卵黑色素具有较强的抗氧化活性，清除超氧阴离子的IC50值为1.250 mg/mL，清除羟自由基的IC50值为0.662 mg/mL。陈士国等[24]测定了鱿鱼墨黑色素对羟基自由基与超氧阴离子自由基的清除活性，结果表明其清除超氧阴离子自由基和羟基自由的IC50值分别为0.015 mg/mL和0.2 mg/mL。动物黑色素抗氧化性大小因动物种类而存在差异，物种不同，其抗氧化活性也不同。

3 结论

木瓜蛋白酶酶解可以去除黑色素中蛋白质，碱溶酸沉可以去除黑色素中其他不被酶解的杂质，得到高纯度的大鲵黑色素。单因素及正交实验确定大鲵皮肤黑色素最适提取工艺条为：氢氧化钠1.5 mol/L、液料比1∶15、提取温度45 ℃，提取率最高为0.65%。

大鲵皮肤黑色素的紫外最大吸收波长为214 nm，由真黑色素和脱黑色素两种色素组成，对羟自由基和超氧阴离子有一定的清除作用，具抗氧化作用。食用不脱除色素的大鲵系列产品时，黑色素可进入人体，发挥其抗氧化、延缓衰老功效。此外，工业化生产时，还可对大鲵皮黑色素进行脱除，将其添加到防晒品、美容护肤品和药品中，促进大鲵产业的发展。