特应性皮炎患者外周血中Th22、Treg细胞及其细胞因子表达的研究

李 志，杨婷婷，李文哲

(1.大连市中心医院 检验科,辽宁 大连116033；2.大连医科大学基础医学院,辽宁 大连116044)

特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种发病过程漫长且反复发作的皮肤病，在儿童期发病较高，呈上升趋势，虽然治疗的方法有很多[1]，但是由于其发病机制没有全部弄清，并不能进行特效治疗，给患者带来巨大的痛苦。因此对特应性皮炎的发病机制进行深入的研究有着重大的意义。AD的发病机制十分复杂，目前普遍认为本病是由先天免疫缺陷和后天环境因素相互作用引起的。而CD4+T细胞在AD的发病中所发挥重要的作用已得到普遍认同。CD4+T细胞是一类功能复杂的细胞群，根据其所产生的细胞因子不同，可以分为多个亚群。传统的研究发现AD的发病机制与Th1/Th2细胞失衡有着密切的关系，近年来，多种CD4+T细胞亚群的发现更加完善了Th1/Th2细胞失衡理论。很多学者已经通过大量的研究发现T细胞22(Th22)、调节性T细胞(Treg)等细胞均参与AD的病理过程并在其中扮演着非常重要的角色。皮肤中的Th22大多数是由树突状细胞和朗格汉斯细胞分化而来，其分泌的IL-22能够破坏皮肤的屏障功能。Cosmi等发现[2]，Treg细胞就有抑制Th1和Th2的作用，并且对于Th2活性的抑制低于Th1。本研究主要通过检测AD患者的外周血中Th22细胞和Treg细胞的比例以及血清IL-22、TGF-β的表达，并分析这些细胞及其细胞因子与AD严重程度之间的关系，从而进一步的讨论Th22细胞和Treg细胞在AD患者发病机制中的价值，以便于临床采取更好的治疗措施来控制患者的病情。

1 材料与方法

1.1 标本采集

选取2017年8月至2018年3月在大连市中心医院就医的特应性皮炎患者52例初诊病例作为患者组，这些患者的病情严重程度按照欧洲特应性皮炎评分标准(SCORAD)进行评分[3]，按分值从高到低分为3组，>50分为重度组，25-50分为中度组，0-25分为轻度组。其中轻度AD组20例，中度AD组18例，重度AD组14例。4组对象在性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。20例健康人为对照组。

1.2 主要试剂

FITC标记-抗人CD4单克隆抗体(CD4-FITC)、IntraPrepTM固定剂以及破膜剂均购自美国Beck-Man公司；PE-IL-22，PE-Foxp3 单抗均购自美国eBioscience公司；淋巴细胞分离液、RPMI-1640培养基等均购自美国Sigma-Aldrich公司；人IL-22 ELISA试剂盒、人TGF-βELISA试剂盒，购自美国R&D公司。(2)主要仪器设备：流式细胞仪购自美国Beck-Man公司。

1.3 样本采集和处理

采集受检者在清晨空腹条件下的静脉血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中,EDTA抗凝管中的血用于Treg细胞的检测以及用密度梯度离心法Ficoll分离单个核细胞(PBMCs)后对Th22细胞的检测。促凝管中的血分离血清后，取上层血清置于-70℃的冰箱中保存用于ELISA检测细胞因子IL-22和TGF-β的浓度。

1.4 实验方法

1.4.1Th22细胞和Treg细胞的流式检测

将分离后的外周血单个核细胞(PBMCs)进行两次洗涤后重悬于RPMI-1640培养液中，然后将CD4-FITC单抗加入细胞悬液中进行混匀后避光孵育20 min。再在标记后的PBMCs中加入刺激培养液，使得细胞浓度调整至1×106/ml，随后置入培养箱孵育4 h后，用PBS洗涤两次。再将洗涤后的细胞悬液采用IntraPrepTM试剂进行固定和破膜，将破膜后的悬液再经过两次洗涤后平均分成2管，分别加入PE-IL-22和同型对照IgG1-PE各10 μl,再避光孵育30 min后洗涤两次。最后,采用流式细胞仪测定已经标记细胞的荧光强度。

取外周全血200 μl加入CD4-FITC单抗，用于Treg细胞的标记，将标记后的全血样本用PBS洗涤两次后，用试剂ItraPrepTM 进行固定和破膜。将破膜后的悬液再经过两次洗涤后平均分成2管，分别加入PE-Foxp3抗体和Foxp3对照抗体进行细胞内细胞因子的标记,孵育30 min。最后,采用流式细胞仪测定已经标记细胞的荧光强度。

1.4.2ELISA检测血清中IL-22和TGF-β浓度

将已经分离好的上层血清取出后，用ELISA的方法检测血清中细胞因子IL-22和TGF-β的浓度，在检测时严格按照IL-22和TGF-β各自的ELISA试剂盒的操作说明进行操作。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 外周血中Th22和Treg细胞的比例

与健康对照组相比，轻、中、重度特应性皮炎患者外周血中Th22 细胞的比例均显著增高(P<0.000 1)，Treg细胞的比例显著降低(P<0.000 1)；与轻度、中度特应性皮炎患者相比，重度特应性皮炎患者外周血Th22 细胞的比例显著增高(P<0.000 1)，Treg 细胞的比例显著降低(P<0.000 1)，见表1。

表1 各组受试者外周血中Th22和Treg细胞表达比列

注：与健康对照组相比较，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；与轻度、中度AD患者相比较★P<0.0001。

2.2 血清中IL-22、TGF-β的水平

与健康对照组相比，轻、中、重度特应性皮炎患者血清中IL-22 细胞因子的水平均显著增高(P<0.0001)，中、重度特应性皮炎患者TGF-β细胞因子的水平显著降低(P<0.0001)，轻度特应性皮炎患者TGF-β细胞因子的水平与健康对照组无显著差异(P=0.1430)；与轻度、中度特应性皮炎患者相比，重度特应性皮炎患者血清中IL-22 细胞因子的水平显著增高(P<0.0001)，TGF-β细胞因子的水平显著降低(P<0.0001)，见表2。

表2 各组受试者血清中IL-22和TGF-β细胞因子表达水平

注：与健康对照组相比较，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；与轻度、中度AD患者相比较★P<0.0001。

3 讨论

特应性皮炎通常开始发生于婴幼儿时期，其病程漫长呈反复发作的过程[4]。在大约三分之一的患者中，AD与过敏表现有关(如哮喘、食物过敏、季节性过敏)。最近，协会也报告了其他的疾病，包括类风湿性关节炎、胃肠病、系统性红斑狼疮。还有数据显示这种疾病是增加心血管疾病的危险因素[5]。患者皮肤往往会发生剧烈瘙痒，严重影响了患者的正常生活。在发达国家中儿童的AD患病率可高达10%-20%[6]。在我国，AD的患病率也是稳中有升[7，8]。

AD的发病机制十分复杂，是免疫、遗传、环境、病理、生理等各种各样的因素相互作用从而产生的结果。传统的观点认为免疫畸变是AD起始发展的一个主要事件(“从内到外的假设”)。而现在有另一种假设认为AD是因为表皮屏障存在固有缺陷。由于表皮屏障缺陷，刺激物或者是过敏原可以非常轻易地穿透表皮屏障，然后会诱发免疫反应(“由外到内假设”)。近年来，由于在AD患者中发现丝聚合蛋白突变使得表皮屏障的缺损比免疫畸变得到了更多的支持[9]。皮肤屏障要发挥正常功能必须依赖丝聚合蛋白，因此丝聚合蛋白基因(FLG基因)的缺陷是导致皮肤屏障缺陷的至关重要的因素。早在2006年McLean等通过对北欧人群进行调查研究，发现近20%的AD病例与FLG基因的突变失活有关[10]。然而FLG基因发生突变的大多数患者病情最终也得到缓解，况且还存在着大部分AD患者的FLG基因并没有发生突变，因此单纯的FLG基因突变并不能解释所有的AD发病机制。与此同时，claudin蛋白与皮肤屏障的缺损也有着非常重要的关系，它在角质层不能发挥正常功能时，可以起到额外的屏障作用[11]。Kuo等[12]的研究已经证实AD患者存在着表皮claudin蛋白含量下降的临床表现。不仅Th2细胞与表皮claudin蛋白的表达呈负相关，而且皮损区Th2细胞因子水平与表皮claudin蛋白的表达也呈负相关，这提示Th2细胞因子具有使上皮细胞claudin蛋白下调的作用。

Th22 是和Th2细胞、Th1 细胞等不一样的新型辅助性T 细胞亚群，主要通过分泌IL-22等的细胞因子从而对皮肤屏障功能产生破坏作用[13，14]。Th22细胞的作用主要与疾病的内在机制有关，它可诱导表皮增生，也可抑制蛋白参与不真皮分化和皮肤屏障功能，并上调包括S100A8和S100A9的抗菌肽。本研究发现，特应性皮炎患者的病情严重程度与Th22细胞及IL-22细胞因子的表达成正相关。是因为在发炎的皮肤中，Th22可以通过增强趋化因子和TNF-α诱导的细胞因子来促进免疫反应[15]，并且在角化细胞中，IL-22降低了丝聚合蛋白的表达，加剧了表皮屏障功能障碍[16]。它主要是通过抑制角质丝聚合蛋白转录后加工酶的表达从而使丝聚合蛋白的表达降低，进而加重皮肤的损伤[17]。任小丽[18]等研究证实Th22细胞在特应性皮炎患者中分泌的IL-22升高，且与特应性皮炎患者的病情严重程度和发病机制有着一定的关系，与本研究结果相似。Th22在特应性皮炎的免疫发病机制中起着重要的作用，但是其具体以什么方式参与的还有待研究，随着越来越彻底的研究会使针对细胞因子的靶向治疗在特应性皮炎的治疗中发挥重要作用。

Tregs通过抑制不同免疫细胞的分化和增殖，在免疫反应中有着很关键的作用[19]。本研究发现，Treg细胞及TGF-β细胞因子在特应性皮炎患者体内表达减少。Treg主要是通过产生TGF-β和IL-10来抑制免疫反应的，其机制是通过表达CTLA-4，然后CTLA-4通过携带酪氨酸抑制基序(ITIM)与B7结合后从而抑制T细胞的增殖和分化[20]。Cosmi等[21]发现Treg细胞具有抑制Th1和Th2的作用，并且对Th1的抑制强于Th2，从而导致Th1/Th2的比例失衡。Ma L[22]等研究发现Treg细胞及TGF-β与特应性皮炎存在着一定的关系，在特应性皮炎中比例降低，与本研究结果相似。然而Ou LS[23]等研究中指出AD患者外周血中Treg细胞明显升高，与本研究结果截然相反，可能是由于AD的发病机制十分复杂，其他的免疫因素改变了Treg细胞的数量，从而削弱和掩盖了Treg细胞及其细胞因子在AD中的作用。随着研究的深入，会使通过对TGF-β细胞因子的靶向治疗以及利用抗CTLA-4单抗来阻断Treg细胞从而减轻Treg对免疫的抑制作用成为可能。

不同的免疫细胞通过其分泌的细胞因子在机体的微环境中相互作用，发挥各自的功能，维持机体的免疫稳态。Th22和Treg细胞及其细胞因子IL-22和TGF-β在特应性皮炎发病过程中发挥重要作用，可以为特应性炎的实验室诊断提供重要参考，对特应性炎的疗效评估具有重要意义。