家蚕狭胸(narrow breast, nb)突变性状观察及基因的精细定位

刘品彦 刘茹凤 丛江珊 刘 春

(1.家蚕基因组生物学国家重点实验室，2. 农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室，重庆 400716)

家蚕是重要的经济昆虫，又是遗传学研究的良好材料。早在5000年前，人们就开始驯养家蚕。如果从1906年由日本遗传学家外山龟太郎开展蚕丝性状及形态突变的研究算起，至今家蚕遗传学研究历史已逾100年，并取得了丰硕的成果。全世界保存了大约1000种左右的突变体，其中西南大学家蚕基因资源库保存了约有600份突变体。28个连锁群现已全部发现，到2005年发表最新的经典遗传图谱上共有246个形态和生化标记，其中有196个已经被定位在每个连锁群上具体的座位上[1]，其它的分子图谱也在20世纪90年代纷纷完成[2-5]。特别是到了21世纪，BAC文库、EST文库、家蚕基因组计划、SNP连锁图谱相继实施及完成[6-11]，为利用定位克隆的手段开展家蚕突变体分子遗传研究奠定了坚实的基础。从2008年3月报道的第一个利用定位克隆阐明无翅(fl)突变机理[12]到现在，已经有包括nsd-2、ow、od、bts、C、sch、mln、cts等突变种通过定位克隆的手段阐明了突变的分子机理[13-21]。

狭胸(narrowbreast,nb)突变种属家蚕的自然突变，最早于1953年由日本学者筑紫发现，该突变为隐性突变，幼虫胸部狭窄，腹部肥大，近纺锥形，手触松弛。该突变位于家蚕经典遗传连锁图中第19连锁群19-31.2座位上，该连锁群上还有Pes(19-0.0)、Gl(19-19.2)、Ict-D(19-29.1)、Alb(19-37.4)、msn(19-45.8)5个已定位标记和4个未定位标记。该突变是少数几个关于家蚕形体的突变体，但其突变基因还未被分离克隆，其突变机理未知。为此，本研究首先对其突变性状进行了观察，并利用SNP标记对突变基因进行了精细定位，为分离和克隆突变基因奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验选取西南大学家蚕基因库系统编号为18-110的nb突变种及大造作为材料，常规桑叶饲育。以nb及大造作为亲本，F1雄个体与nb雌个体回交后，根据突变表型对BC1代回交群体进行单个样品收集，液氮速冻后提取基因组DNA进行连锁分析。

1.2 外部形态及内部器官观察

分别选取健康而且大小适中5龄第3d和5龄第7d的nb/nb，nb/+进行观察拍照。取健康而且大小适中5龄5d家蚕大造和nb，从背部解剖，保持消化道的整体完整性，对位于胸部的消化道进行形态观察拍照。

1.3 基因组的提取

本实验中使用的亲本P代及F1代基因组利用DNAzol试剂(Roche公司)提取，回交群体基因组利用高通量的核酸自动抽提仪(Kurobo-PI1200，日本)进行提取。操作方法按试剂盒说明书和仪器说明书进行。提取的基因组DNA利用家蚕看家基因rpl3进行PCR扩增，检测基因组质量。在抽检的样品中其出带的比例达95%以上表明基因组DNA质量可用于后续工作。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性10 sec，55℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，30个循环，72℃ 7 min，4℃保存。

1.4 SNP标记引物及SNP位点鉴定

本实验主要利用SNP标记对nb突变基因进行精细定位，其SNP标记的引物序列主要根据Yamamoto[10]等人2008年公布的家蚕SNP图谱中引物信息。利用亲本基因组DNA 作为模板进行PCR扩增，电泳检测后进行PCR产物测序，其测序方法如下：首先使用SAP酶(TaKaRa公司)及Exonuclease I对PCR产物进行消化，反应条件：37℃ 20 min，80℃ 30 min。然后进行测序PCR反应，PCR反应条件：96℃ 1 min， 96℃ 10 sec，50℃ 5 sec，60℃ 4 min，25个循环，4℃保温。最后使用乙醇醋酸钠沉淀法对测序样品进行纯化。使用HITACHI3730测序仪进行测序分析。

表1 SNP标记引物

续表1 SNP标记引物

1.5 扩增产物的SNP位点查找

1.6 连锁分析

在构建连锁图谱时，把nb表型的个体标记为A，正常表型的个体标记为H，亲本大造在SNP位点表型标记为B，亲本nb在SNP位点的表型标记为A，F1在SNP位点的杂合型标记为H，后面BC1的SNP位点表型也根据以上方法进行标记，统计结果整理放入Excel表格。

2 实验结果及分析

2.1 nb突变体表型观察

对不同发育时期的nb表型进行观察，发现在幼虫期的3龄末期即可从外观体型上区分nb突变种和正常个体(nb/+)，从4眠开始正常个体和nb突变种间的体型差异开始明显，到5龄后期，nb突变种表型明显，胸部与身体的比例变小，胸部缩小，腹部膨大，导致nb突变种的整体呈纺锤体形，这种明显的体型差异一直持续到蛹期(图1)。对其体长和体重进行测定，表明体重基本没有差别，但是nb的体长短于正常个体。

图1 nb/+和nb/nb基因型幼虫期及蛹期的身体形态观察

2.2 前肠形态观察

因nb的表型差异主要出现在胸部，该区域主要包含较大的消化器官。为了观察该区域的消化器官是否有异常，因此，本实验对5龄5d正常食桑的正常表现及突变表型的回交个体进行解剖观察。结果表明，正常个体的前肠部分在食道区域充满了桑叶碎片，与后面的中肠连接呈现漏斗状，其形态是逐渐增大的过程。而在突变表型个体中，食道处未被桑叶碎片充盈且收缩，后面直接与膨大的中肠相连接 (图2)，这可能是引起nb胸部狭小的形态原因。

图2 nb和大造食道比较

2.3 低密度连锁图谱的构建

虽然在形态上已经看到了差异，但nb突变基因却未知，为此，本实验利用定位克隆方法对nb突变基因进行了连锁定位。本研究利用大造和nb为亲本构建BC1群体用于开展定位克隆，设计了27对引物用于初定位，其中包括21对SNP引物和6对SSR引物。经过筛选，我们获得了可用于定位的标记10个。利用这些标记和92个BC1代个体构建了低密度连锁图谱，该图谱包含40个交换个体。通过分析，我们把nb锁定在标记3和8之间，这两个标记的遗传距离为7.8cM，物理距离约为1.7Mb。

2.4 高密度连锁图谱的构建

然后，我们利用初定位标记3和8从1794个BC1代个体中筛选得到67个交换个体。随后，我们新设计了15对用于精细定位的SNP引物，经过筛选，获得了13个可用于定位标记。利用9个标记和67个交换个体构建了高密度连锁图谱，该图谱包含了8个标记，54个交换个体。通过分析，我们把nb锁定在标记31和38之间区域，该区域物理距离约为1Mb(图3)。通过对定位区域进行基因预测，发现该区域内含有44个基因。结合低密度连锁图谱及高密度连锁图谱，绘制nb的定位连锁示意图(图4)。

3 讨论

nb突变体是家蚕少数的体型突变体之一，由于其突变基因未被分离克隆，其突变机理未知。本研究为了揭示其突变机理，本研究首先对其突变形态进行了观察，发现nb在食道处与正常相比存在差异；对其进行定位克隆，将其突变基因锁定在1Mb的范围内，该研究为nb突变基因的分离克隆奠定了基础。

图4 nb定位连锁示意图

本研究的一个新的发现是nb的前肠部分与正常相比有差异，推测该形态变化是导致其表型出现胸部狭小的主要原因。由于家蚕的体型主要受外骨骼及内部器官的形态而决定，nb蚕与正常相比表现为胸部狭小，腹部膨大。对其胸部的前肠器官进行解剖观察，发现该区域在nb中，其前肠在食道处缢缩，与其紧密连接的中肠迅速膨大。正常表型个体只在咽喉部缢缩，在食道处呈现漏斗状的膨大形状。我们推测，这样的前肠形态导致nb的梭形体型。由于前肠壁有大量的肌肉组织，是否这些肌肉组织发育异常导致其形态的变化特征还有待进一步研究。

同时，本研究以大造和nb为亲本配置BC1代定位群体。利用92个BC1代个体和10个标记构建了低密度连锁图谱，把nb相关基因锁定在1.7Mb的区域内。进一步利用1794个BC1代个体和8个标记构建了高密度连锁图谱，把nb相关基因锁定在1Mb的区域内。对定位区域进行基因预测发现含有44个基因。初步的基因注释分析发现，在这些预测基因中，有11个表皮基因，其中一个编号为BGIBMGA001945含有Tsg结构功能域，该基因和果蝇的cv基因具有很高的相似性。cv基因具有调控果蝇成虫跳跃肌(TDT)肌纤维数量的功能[22-24]，在后期的研究中，该基因将作为nb的主要候选基因进行深入的研究。