千金藤素通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬*

项福英，江胜林，程贤鹦

(浙江医院，浙江 杭州 310030)

卵巢癌是在世界范围内死亡率最高的妇科恶性肿瘤，目前卵巢癌患者的治疗以手术和化疗为主，且预后差，致死率较高[1]。因此，迫切需要研制一种治疗卵巢癌的新方法和新药物。千金藤素(cepharanthine)是一种从防己科千金藤属植物千金藤中提取的异喹啉生物碱，具有广泛的药理作用。近年来，cepharanthine在肿瘤中的各种药理学作用引起了研究人员关注。研究表明，cepharanthine可以抑制结直肠癌细胞和黑色素瘤细胞的增殖[2-3]，诱导肺癌细胞凋亡[4]，逆转化疗药物的耐药[5-6]。然而，cepharanthine是否诱导卵巢癌细胞的自噬，分子机制又如何，目前研究较少。本实验旨在研究cepharanthine对卵巢癌SKOV3细胞自噬的作用及可能的分子机制，为cepharanthine用于卵巢癌的临床治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞株 人卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海细胞所。

1.2主要试剂 Cepharanthine购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度>98%；吖啶橙(acridine orange)、DMSO和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)购自Sigma；胎牛血清购自Gibco；RPMI-1640培养基购自吉诺生物医药技术有限公司；CCK-8试剂盒购于碧云天生物科技公司；抗LC3、AKT、p-AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1细胞培养 卵巢癌SKOV3细胞培养于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。每3 d传代1次。

2.2CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期SKOV3细胞调整细胞悬液浓度，以每孔5.0×103个细胞接种于96孔板中，当细胞生长融合至60%时，各组中加入不同浓度的cepharanthine处理24 h，其浓度分别为2、4、8、16和32 μmol/L，对照组中加入等体积的PBS，每个浓度设置6个复孔，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，药物作用结束后，弃去培养基，每孔加入 1∶10稀释过的CCK-8溶液100 μL，在培养箱中继续培养3 h后，用酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度(A)值，取平均值。实验重复3次。

2.3吖啶橙染色 取对数生长期卵巢癌SKOV3细胞以2×104接种于24孔板，于培养箱中培养过夜，第 2天加入不同浓度的cepharanthine作用于卵巢癌SKOV3细胞24 h，弃去24孔板中的旧培养液，用PBS清洗3遍，用含终浓度为1 mg/L的吖啶橙溶液避光染色15 min，用PBS清洗染色后的细胞，清洗3遍，于倒置荧光显微镜下观察，拍照。实验重复3次。吖啶橙能够透过细胞并与胞质内酸性细胞器相结合，当处于较低pH环境中可发出红色荧光。卵巢癌SKOV3细胞经吖啶橙染色后，通过倒置荧光显微镜观察，无自噬产生的细胞质呈绿色荧光，含有自噬溶酶体者呈红色荧光。

2.4Western blot法检测蛋白表达水平 取对数生长期SKOV3细胞以2×105接种于6孔板中，置培养箱培养过夜。对照组给予正常培养液，给药组分别给予8 μmol/L和 16 μmol/L cepharanthine作用24 h。收集细胞，提取总蛋白，然后用BCA法测定各组蛋白浓度进行定量。将定量后的蛋白样品加入到配制好的丙烯酰胺凝胶泳道中电泳分离，然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，用含5% BSA的溶液将膜室温封闭1 h后用TBST清洗3次，分别加入对应I抗[LC3(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)]，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜后，加入对应羊抗兔II抗(1∶3 000)，室温摇床孵育2 h后，TBST洗膜3次，ECL发光试剂盒发光显影，定影后进行分析。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响

采用CCK-8法检测cepharanthine对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响。不同浓度(0、2、4、8、16和32 μmol/L)的cepharanthine作用于SKOV3细胞作用24 h，随着药物浓度的增加，cepharanthine对细胞活力的抑制逐渐增强(P<0.01)，见图1，提示cepharanthine作用于SKOV3细胞后，细胞活力被显著抑制。

2 千金藤素诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬溶酶体的生成

与对照组相比，不同浓度cepharanthine处理24 h后，随着cepharanthine浓度增加，卵巢癌SKOV3细胞中染成亮红色荧光比例增多，自噬程度逐渐增强，其中8 μmol/L和16 μmol/L cepharanthine组较为明显，见图2，提示细胞中自噬溶酶体的数量可能增多，自噬被激活。因此，后续实验选择8 μmol/L和16 μmol/L作为实验浓度。

Figure 1.The effect of cepharanthine on the cell viability in different groups after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

图1 不同浓度的千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响

3 千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响

用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达情况。实验结果显示，在8 μmol/L和16 μmol/L cepharanthine 作用下，自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平显著升高(P<0.01),见图3。这说明cepharanthine可诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬。

4 千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，卵巢癌SKOV3细胞在8和16 μmol/L cepharanthine作用24 h后，p-AKT和p-mTOR蛋白水平显著降低(P<0.01)，而AKT和mTOR的总蛋白水平无明显变化，见图4。这一结果表明cepharanthine抑制了AKT和mTOR的磷酸化，PI3K/AKT/mTOR信号通路可能参与了cepharanthine诱导的SKOV3细胞自噬。

Figure 2.The change of autophagy vesicles in the ovarian cancer SKOV3 cells after treated with cepharanthine (acridine orange staining,×400).

图2 不同浓度的千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞自噬的影响

5 千金藤素联用 3-MA对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响

CCK-8法检测cepharanthine联用自噬抑制剂3-MA(在加入cepharanthine前1 h加入3-MA 抑制自噬的发生)后SKOV3细胞活力的变化。实验结果表明，与对照组比较，在3-MA 与cepharanthine联合给药干预下，3-MA促进了cepharanthine对卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制作用(P<0.01)，见图5。这提示自噬抑制剂3-MA 联合cepharanthine作用能增强cepharanthine对卵巢癌细胞活力的抑制作用。

讨 论

卵巢癌是常见的恶性肿瘤，它的发病率和病死率在世界范围内持续上升，化疗是目前卵巢癌最有效的治疗方法，但由于化疗的毒副作用较大，预后差，因此寻找治疗卵巢癌的新方法及新策略有重要意义[7]。千金藤素为一种双苄基异喹啉型生物碱，是从防己科千金藤属植物千金藤中提取分离出来的有效成分。千金藤素具有多种药理作用，其抗肿瘤作用近年来研究较多，它可通过多种机制参与肿瘤的预防和治疗，包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，逆转肿瘤细胞多药耐药性等。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱin the ovarian cancer SKOV3 cells treated with cepharanthine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

图3 千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞LC3蛋白表达的影响

自噬是在应激条件下参与细胞稳态的一种分解代谢过程，其功能在肿瘤的发生、发展中起着不可忽略的作用[8]。本研究应用CCK-8法检测细胞活力发现，cepharanthine能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞活力，吖啶橙染色结果显示经cepharanthine药物干预后细胞中酸性自噬泡染成红色比例显著增多，Western blot检测结果显示cepharanthine作用后自噬相关蛋白分子LC3-II的表达水平显著升高。这些结果说明了cepharanthine能诱导卵巢癌SKOV3细胞发生自噬。然而，自噬作为一把“双刃剑”，它可以是细胞在应激条件下的一种保护反应，也可以启动Ⅱ型程序性细胞死亡[9-10]。为了明确自噬在该药物的抑瘤过程中起到的作用，我们采用自噬抑制剂3-MA提前孵育SKOV3 细胞1 h以阻断自噬的作用。CCK-8法检测cepharanthine联用自噬抑制剂3-MA后SKOV3细胞活力的变化[11]。实验结果表明，在3-MA与cepharanthine联合给药干预下，与对照组相比，3-MA 促进了cepharanthine对卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制作用。这表明cepharanthine诱导卵巢癌SKOV3 细胞发生自噬是细胞自身的一种保护性机制，使用自噬抑制剂能增强cepha-ranthine对卵巢癌SKOV3细胞的杀伤作用。然而，cepharanthine诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬的分子机制尚不清楚。

Figure 4.The protein levels of p-mTOR and p-AKT in the ovarian cancer SKOV3 cells treated with cepharanthine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

图4 千金藤素对卵巢癌SKOV3细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目前已发现调控自噬的信号通路有很多，其中PI3K/AKT/mTOR信号通路是研究最为广泛的信号通路之一[12-13]。当细胞受到刺激后，PI3K激酶被激活，然后通过激活AKT磷酸化，进而激活下游的mTOR等信号分子，发挥相应的生物学效应，其核心蛋白 mTOR的活化是决定自噬体形成和成熟的关键蛋白[14-15]。抑制mTOR的功能，使PI3K/AKT/mTOR通路失活，则可以诱导自噬[16]。在本实验中我们发现在cepharanthine作用卵巢癌SKOV3细胞后，AKT及下游蛋白mTOR的磷酸化表达随cepharanthine浓度增高而逐渐降低，这说明cepharanthine可能与抑制PI3K/AKT/mTOR通路导致卵巢癌SKOV3细胞发生自噬。本研究虽证明了cepharanthine能够通过抑制 PI3K/AKT/mTOR通路导致卵巢癌SKOV3细胞发生自噬，但其具体作用机制还需继续深入研究。后续实验中我们将进行挽救实验进一步验证cepharanthine是否通过抑制PI3K/AKT/mTOR 通路导致卵巢癌SKOV3细胞发生自噬。

Figure 5.Combination of cepharanthine and 3-MA resulted in a substantial decrease in the cell viability compared with using cepharanthine alone. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscepharanthine 8 μmol/L group;&&P<0.01vscepharanthine 16 μmol/L group.

图5 千金藤素联用3-MA对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响

综上所述，本实验通过检测自噬溶酶体、自噬标志物以及相关的信号通路，初步研究表明cepharanthine能诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬，并且该作用可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。这为cepharanthine应用于卵巢癌的临床治疗提供了实验依据。