川芎嗪对LPS致神经认知障碍的影响及功能影像学评价*

李光明，管雪琴, 刘思思，梁敏杰，潘 锐, 唐海杰, 颜学勤，王会丽，颜 亮，付咏梅，周 全，董 军△

(1暨南大学医学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理学实验室，粤港澳中枢神经再生研究院，2暨南大学附属第一医院骨科，3暨南大学附属第一医院医学影像中心，广东 广州 510632；4南方医科大学第三附属医院，广东 广州 510630)

神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、亨廷顿(Huntington disease，HD) 和HIV 相关神经认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)等[1]，表现为蛋白质在大脑中错误折叠、聚集和积累导致神经毒性，可影响抽象思维、熟练动作、情绪感受、 认知和记忆等能力[2]，从而出现认知功能障碍。然而，目前临床上治疗神经认知障碍的药主要是缓解症状，并没有改变神经元的丢失和退化。中药川芎嗪是从川芎块茎提取的酰胺类生物碱，主要成分是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)[3]。研究表明，川芎嗪可扩张脑血管，降低血管阻力，显著增加脑及肢体血流量，改善微循环；能降低血小板表面活性、抑制血小板凝聚、预防血栓的形成；抗炎、抗氧化、保护神经等作用[4]。但川芎嗪对神经认知障碍的研究尚未见报道。

我国老龄化进程加剧，对神经认知障碍的认识和预防迫在眉睫。神经认知障碍是神经退行性疾病的主要表现之一，进一步恶化可能导致阿尔茨海默病[5]。 因此，早期发现及诊断神经认知障碍并对其进行干预对于延缓其向神经退行性疾病转化具有现实意义。神经影像学检查是痴呆及神经认知障碍诊断不可或缺的一部分，但是功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)还只限于临床研究[6]。本研究应用体素内非相干运动(intra-voxel incoherent motion，IVIM)技术分辨神经影像学特征，特别是认知障碍早期的影像学及脑微观结构的改变。IVIM是近年兴起的一项 MRI 新技术，由Le Bihan等[7]在20世纪80年代提出，理论前提是在生物组织内，除考虑组织内水分子扩散外，微循环毛细血管灌注的影响也是不可或缺的[8]。IVIM成像可通过扩散系数(diffusion coefficient, D)和伪扩散系数(pseudodiffusion coefficient, D*)分别评价纯水分子扩散运动成分和血流灌注相关的扩散运动，从而达到无创评价组织微观结构及微循环灌注情况的目的[9]。

神经退行性疾病的发病机制与中枢神经系统损伤部位的潜在炎症过程有关，称为“神经炎症”[10]。原发性神经元损伤可能通过释放营养因子和炎症介质引起局部神经炎症[11]。脑立体定向注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是目前用来诱导脑内神经炎症的模型[12]。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组成成分，能诱导炎症，对免疫细胞有不同的作用，可作为脑炎症诱导剂[13]。本研究通过观察川芎嗪对LPS所致大鼠神经认知障碍的影响，并测定脑纯水分子扩散运动和血流灌注探讨川芎嗪减轻LPS致神经认知障碍的作用及功能影像学分子机制，为防治神经退行性疾病提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 动物

采用SPF级健康雌雄各半SD大鼠36只，鼠龄4～8周，体重120～180 g，由济南朋悦实验动物中心提供(动物合格证编号3700920006246)。饲养于暨南大学实验动物中心SPF环境，饲养温度(22±2)℃，12 h昼/夜交替照明，自由进饮进食；在暨南大学实验动物中心适应环境，过10 d隔离检疫期后，开始实验。本实验完全按照暨南大学实验动物伦理委员会的要求进行。

2 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠购自Sigma；LPS购自Sigma；盐酸川芎嗪注射液购自成都倍特药业有限公司(国药准字号H32013383)；大鼠白细胞介素(interleukin, IL)-1β(SEA563Ra)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α(SEA133Ra)ELISA试剂盒购自武汉优尔生有限公司。脑立体定位仪和颅骨钻购自瑞沃德公司；3.0T核磁共振成像仪购自飞利浦公司。

3 主要方法

3.1构建LPS致神经认知障碍模型及分组 侧脑室注射(intracerebroventricular injection，icv):首先用3%的戊巴比妥钠对大鼠腹腔注射(1.5 mL/kg)进行麻醉，后将其固定于脑立体定位仪上，碘伏消毒头顶部皮肤，头顶正中由前向后作长约1 cm手术切口，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟后1.0 mm、矢状缝(mediolateral，ML)左右1.8 mm为注射点，进针深度(dorsoventral，DV)3.8 mm。准确定位后，先用黑笔标记，然后用颅骨钻打孔，见脑脊液溢出停止钻孔，然后把制作好的套管，插入侧脑室里，用牙科水门汀封胶固定。手术观察3 d后，把用人工脑脊液 (artifical cerebrospinal fluid,ACSF)配制的LPS溶液 (1 g LPS溶入10 mL ACSF中，配成100 mg/L LPS母液；取15 μL LPS母液，加入35 μL ACSF配成150 μg/5 μL的LPS溶液)5 μL用微量进样针沿套管插入缓慢注射，每注射2 μL停针2 min。注射完毕后，留针10 min，缓慢退针；消毒后，用牙科水门汀封胶。实验动物编号，水迷宫训练完成后，根据水迷宫逃避潜伏期，利用随机数字表法，随机分为6组，每组6只：(1)空白对照组(control group)：腹腔注射0.9%生理盐水，每只10 mL/kg，注射5 d；(2)假手术组(sham group)：先行腹腔注射0.9%生理盐水，每只10 mL/kg，注射5 d；icv法将ACSF注射入大鼠脑内，每只5 μL，注射1次；(3)模型组(model group, LPS group):先行腹腔注射0.9%生理盐水，每只10 mL/kg，注射5 d;再icv法将150 μg, 5 μL LPS注射入大鼠脑内，每只5 μL，注射1次；(4)低剂量组(low dose group)：先行腹腔注射盐酸川芎嗪注射液每只50 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把50 mg/kg盐酸川芎嗪注射液配制成5 g/L)，注射5 d；再icv法将150 μg/5 μL LPS注射入大鼠脑内，每只5 μL，注射1次；(5)中剂量组(medium dose group)：先行腹腔注射盐酸川芎嗪注射液,每只100 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把100 mg/kg盐酸川芎嗪注射液配制成10 g/L)，注射5 d；再icv法将150 μg/5 μL LPS注射入大鼠脑内，每只5 μL，注射1次；(6)高剂量组(high dose group)：先行腹腔注射盐酸川芎嗪注射液每只200 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把200 mg/kg盐酸川芎嗪注射液配制成20 g/L)，注射5 d；再icv法将150 μg/5 μL LPS注射入大鼠脑内，每只5 μL，注射1次。术程顺利，高剂量组死亡1只。侧脑室注射后第9天，麻醉处死大鼠，取出全脑，备用。

3.2Morris水迷宫实验并检测大鼠空间学习及记忆能力 术后第2天，大鼠进行Morris水迷宫实验。水深约26 cm，平台隐藏于水下，水温(24±1)℃。(1) 第1～6天的定位航行实验检测大鼠学习能力:水迷宫分为 4 个象限，随机将大鼠从任一象限以脸部面向池壁放入水中，记录大鼠找到隐藏平台所需时间，作为潜伏期; 探寻总时长为90 s，若大鼠未能在规定时间内找到平台，则引导其游上平台并在平台停留10 s，其潜伏期记为90 s。(2) 第7天的空间探索实验检测大鼠记忆能力: 实验第7天撤去水下平台，选取平台所在象限的对角象限为大鼠入水点，记录大鼠在 90 s 内穿过平台区的次数及在平台象限内停留的时间。

3.3ELISA检测炎症因子IL-1β和TNF-α的含量 各组织大鼠4%多聚甲醛灌注完全后，各取3只冰上迅速断头取脑，分离皮层和海马。低温匀浆将大脑组织研磨制成匀浆液。4 ℃、12 000×g离心15 min,取上清，后续实验按照IL-1β和TNF-α的ELISA说明书严格操作。

3.4MRI检查 第7天水迷宫结束后，大鼠进行MRI扫描，先用3%戊巴比妥钠麻醉，拆去套管，放到核磁共振成像机器扫描。除了普通序列外，主要扫描IVIM。所有纳入的实验对象均采用 GE 3.0T MR 扫描仪(GE Healthcare Discovery MR 750)完成 MRI 检查，所有数据由腕关节线圈采集。行轴位 T2WI propeller 扫描及IVIM-DWI扫描，扫描参数：(1)T2WI propeller 序列：TR 4295 ms, TE 76 ms,视野(FOV)600 mm×600 mm，矩阵 256×256，层厚 2 mm，层间隙 0 mm，激励次数 2 次; (2)轴位 IVIM-DWI 序列：使用单次激发自旋回波成像序列，TR 3500 ms，TE minimum ms，15个不同的 b 值(0、 20、 30、 50、 80、100、200、 400、 600、 800、 900、1 000 s/mm2)，FOV 600 mm×600 mm，矩阵 128×128，层厚2 mm，层间隙 0 mm，带宽125 kHz。

3.5图像后处理 IVIM-DWI图像后处理：根据经典双指数模型，应用 GE AW 4.5 后处理工作站内置软件，分析图像数据的信号衰减，计算D、D*及灌注分数(perfusion fraction, f)。结合 T2WI序列，分别在海马的2个层面分别勾勒出左右的海马轮廓，画4个感兴趣区域(region of interest，ROI)，并在同层面左右皮层各勾画2个ROI(约2 mm×2 mm)，ROI 的放置应避开右侧侧脑室注射通道，每个 ROI重复勾画3次后取平均值。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。数据以均数±标准误 (mean±SEM) 表示。组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐时组间两两比较用Bonferroni校正的t检验；若方差不齐，则组间两两比较用 Tamhane’s T2 检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 川芎嗪对LPS致大鼠神经认知障碍的空间学习记忆能力的影响

Morris水迷宫定位航行实验0 d(训练结束后的逃避潜伏期)、1 d、3 d、5 d和6 d结果表明，与空白对照组和假手术组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.05)；而川芎嗪低剂量治疗组，大鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.05),见图1A。第 6天定位航行代表性路径图表明，与模型组相比，川芎嗪低剂量治疗组大鼠导航策略变得更好,见图1D。第7天的空间探索实验结果显示，相比假手术组，模型组穿梭平台次数和目标象限停留时间均降低；相比模型组，川芎嗪低剂量组大鼠穿梭平台次数增加，目标象限停留时间延长(P<0.05)，见图1B、C。

2 川芎嗪对神经认知障碍大鼠体内炎症因子IL-1β和TNF-α的影响

ELISA实验结果表明，与假手术组相比，LPS处理组大鼠皮质和海马区IL-1β和TNF-α分别增加(P<0.05)；与模型组相比，低剂量组大鼠大鼠皮质和海马区IL-1β和TNF-α分别降低(P<0.05)，中、高剂量组无显著差异(P>0.05),见图2。

3 川芎嗪改善LPS诱导的神经认知障碍的MRI功能影像学影响

MRI功能影像学扫描图层及ROI测量范围见图3。与假手术组相比，模型组的皮层和海马各组间的D、D*和f值均显著降低(P<0.01)；与模型组相比，川芎嗪低剂量组的D、D*和f值均显著升高(P<0.01),见表1。

讨 论

神经认知障碍是神经退行性疾病主要的临床表现症状，防治神经认知障碍将为神经退行性疾病的研究提供新的策略。随着一些中药新的药理作用和分子机制被发现和揭示，中药将为防治神经认知障碍的治疗提供新方法[14]。本研究行为学检测结果显示，LPS诱导的川芎嗪低剂量组大鼠的学习记忆能力显著改善。已有研究显示川芎嗪可以降低脑缺血再灌注损伤的神经炎症从而减轻脑损伤[15]。在本研究中，我们观察到川芎嗪还可以减轻神经认知障碍程度。

根据现有研究猜测，川芎嗪减轻神经认知障碍的机制可能是川芎嗪可以抑制脑中神经炎症反应，缓解神经细胞的水肿，增加脑中血流循环，从而缓解神经认知障碍。本研究检测到模型组大鼠皮层和海马的IL-1β和TNF-α均显著增加，表示模型组发生了神经炎症，这与 Wu等[16]用LPS诱导大鼠脑神经炎症的结果相似；神经炎症导致神经细胞凋亡、坏死，从而引起神经认知障碍。而用低剂量川芎嗪治疗的大鼠，其皮层和海马区IL-1β和TNF-α均显著降低，表明低剂量川芎嗪可以抑制脑中神经炎症，从而减轻神经认知障碍。

Figure 1.Tetramethylpyrazine improved the spatial learning and memory abilities of SD rats with LPS-induced neurocognitive impairment. A: water maze escape latency; B and C: the times of each animal entering the small target zone and the time spent in the target quadrant; D: the representative swimming path at day 6 of training with space exploration. Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group.

图1 川芎嗪对LPS所致神经认知障碍大鼠空间学习和记忆能力的影响

Figure 2.The effect of tetramethylprazine on the relative expression of inflammatory factors induced by LPS. A: the relative expression of IL-1β in the cortex and hippocampus detected by ELISA; B: the relative expression of TNF-α in the cortex and hippocampus measured by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmodel group.

图2 川芎嗪对神经认知障碍相关炎症因子相对表达的影响

Figure 3.Representative MRI functional imaging scan layer and measurement range. A： the scanned T2WI layer； B: 1 and 2 of regions represent the hippocampus, while 3 and 4 of regions represent the cortex; C: the merged A and B scan sequences.

图3 MRI功能序列扫描层和ROI测量范围

表1 各组大鼠皮层和海马的D、D*和f值

Table 1.The values of diffusion coefficient (D), pseudodiffusion coefficient (D*), perfusion fraction (f) in the cortex and hippocampus of the rats in each group (mm2/s. Mean±SEM)

GroupnCortexHippocampusD (×10-4)D* (×10-3)fD (×10-4)D* (×10-3)fControl67.25±0.1145.80±3.110.28±0.027.73±0.2340.90±2.530.28±0.03Sham67.19±0.18**44.70±3.12**0.27±0.02**7.64±0.24**41.20±2.11**0.27±0.00**Model66.21±0.2020.60±2.240.18±0.026.78±0.1017.50±1.120.16±0.01Low dose69.46±0.49**39.90±3.56**0.28±0.00**8.79±0.52**39.80±1.63**0.25±0.01**Medium dose66.67±0.2121.60±3.010.20±0.017.04±0.1421.30±1.120.16±0.01High dose56.65±0.2819.30±3.960.21±0.006.76±0.2219.50±1.660.17±0.02

**P<0.01vsmodel group.

本研究应用fMRI检查结果显示,LPS诱导的神经炎症分别导致大鼠脑皮层和海马神经细胞实质水分子的弥散程度(D)、水分子之间的伪扩散系数(D*)和血管的灌注分数(f)分别显著降低。分析原因发现神经细胞发生炎症反应，引起细胞的毒性水肿、变性坏死，导致水分子弥散受限；而白细胞聚集，导致微循环淤滞，脑血流量灌注水平降低，引起大脑学习记忆能力降低。这与van Bussel等[8]观察到微血管壁组织弥散能力降低会影响糖尿病引起的学习记忆能力损伤一致，说明影像学结果可以评价海马区发生变化，而是否能评价神经认知障碍的发生，是本研究所致力于探讨的。本研究观察到低剂量川芎嗪治疗的大鼠，其皮层和海马区的实质水分子弥散系数显著升高，表明皮层和海马区神经细胞水分子弥散能力增强，细胞变性水肿得到缓解，炎症反应下降。恰恰如我们期待的那样，我们检测低剂量组大鼠皮层和海马区IL-1β和TNF-α显著降低，神经认知障碍减轻，这可能证实了我们的假设，即我们可以用功能影像学对神经认知障碍进行评价。

慢性低灌注脑损伤是导致神经障碍和认知衰退的重要因素之一[17]，而川芎嗪可降低脑缺血后活化的巨噬细胞、浸润性淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和促炎细胞因子的表达[18]，使微循环恢复正常；并且川芎嗪可以增加脑血流量，改善脑微循环，使血流量增加。本研究观察到低剂量川芎嗪治疗的大鼠，其灌注分数显著增加，大鼠的学习和记忆能力得到显著改善，进一步验证川芎嗪可以减轻神经炎症诱导的神经认知障碍，同时也进一步表明功能影像学可以用于神经认知障碍的评价。

综上所述，本研究首次观察到中药单体川芎嗪可以减轻LPS诱导的神经认知障碍，并从IVIM D、IVIM D*和f这3个方面进行神经认知障碍缓解情况的评价。这些结果将为防治神经退行性疾病的影像学评价提供重要的实验依据。