超声微泡造影剂携绿色荧光蛋白质粒转染大鼠股骨头的研究

陈 磊，张 莉

（齐鲁医药学院 临床医学院，山东 淄博255300）

超声微泡造影剂具有靶向运载作用已在很多实验研究中得到证实［1-4］,利用微泡在超声介导下的空化效应，可以靶向传输基因或药物,达到治疗疾病的目的.目前以超声微泡造影剂为载体治疗的疾病很多，主要集中在肿瘤［5-8］以及某些缺血性疾病［9-13］等.还未见有超声微泡造影剂治疗骨组织疾病的相关报道.本实验通过超声微泡造影剂携绿色荧光蛋白质粒（pIRES2-EGFP）转染大鼠股骨头组织，研究这种方法的安全性和可行性，为以后利用此方法治疗骨科疾病提供理论基础.

1 实验材料和方法

1.1 实验动物

7周龄SPF级SD大鼠40只，体重180～230 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司（许可证号：SCXK［鲁］20140007）提供，雌雄不拘，适应性喂养 1 周，温度 25±1℃.

1.2 实验试剂

免疫荧光蛋白质粒 （pIRES2-EGFP）、DH5a感受态、RNA酶和质粒提取试剂盒采自武汉淼灵生物科技有限公司.超声微泡造影剂冻干粉（SonoVue）采自上海博莱科信谊药业有限责任公司（国药准字J20130045）.HE试剂盒采自武汉博士德生物科技有限公司.EDTA脱钙液、PBS液、4%多聚甲醛采自北京索莱宝生物科技有限公司.超声诊断仪由齐鲁医药学院影像系提供.

1.3 相关液体配制

（1）超声微泡造影剂悬浊液：用0.9%无菌盐水5 mL注入超声微泡造影剂瓶中，轻摇并搁置1～2分钟，待瓶中冻干粉完全溶解后使用.

（2）超声微泡造影剂携免疫荧光蛋白质粒悬浊液：将68 μL微泡造影剂和200 μg免疫荧光蛋白质粒溶入 1 mL 悬浊液中［14］.

1.4 实验动物处理

40只大鼠随机分为实验组30只和对照组10只.实验组再分为A、B、C 3组，并做以下处理：

A组：经尾静脉注射超声微泡造影剂悬浊液（0.5 mL/kg），再分为A1和A2组各5只；

B组：经尾静脉注射免疫荧光蛋白质粒（0.5 mL/kg），再分为B1和B2组各5只；

C组：经尾静脉注射超声微泡造影剂携免疫荧光蛋白质粒悬浊液（0.5 mL/kg），再分为C1和C2组各5只；

对照组：经尾静脉注射生理盐水，再分为对照1组和对照2组各5只.

其中A1、B1、C1、对照1组用3 MHz超声波在股骨头部照射，A2、B2、C2、对照2组不用超声波照射.转染7天后，处死全部大鼠，取股骨头做病理HE染色，观察其安全性；免疫荧光显微镜观察，每组取7～10张切片，每张切片拍1张照片，在Image Pro Plus图像分析软件下进行分析，所得灰度数据与表达强弱成反比，观察其可行性.所得实验数据均采用±s表示，所有数据用GraphPad Prism 5和SPSS 18.0进行分析，结果以P＜0.05为差异显著的标准.

2 实验结果

2.1 安全性研究

2.1.1 形态观察

在转染7天过程中，实验组大鼠毛发光泽，活动灵活，反应灵敏，食欲良好，体重逐渐上升，抓取时能激烈反抗，形态与对照组无明显差异.

2.1.2 HE染色观察

空骨陷窝计数：对照组和实验组股骨头软骨层较厚，成骨活跃，软骨下骨小梁排列规则整齐，致密饱满，骨细胞清晰可见，核较大，多位于中央，偶见骨陷窝空虚，髓腔内可见增生活跃的骨髓组织，造血细胞丰富，无明显差异（P＞0.05），见表 1.

表1 各组实验动物空骨陷窝数比较 （±s；n=5）

表1 各组实验动物空骨陷窝数比较 （±s；n=5）

注：与对照组比较，▲P＞0.05.

空骨陷窝计数/%14.50±1.72对照 2 组 14.30±1.46 A1 组 13.80±1.83▲A2 组 14.50±1.26▲B1 组 14.60±1.81▲B2 组 13.90±1.72▲C1 组 14.30±1.59▲C2 组 14.30±1.73▲组 别对照1组

取股骨头从中剖开，股骨头外观未见变形，骨质坚硬，不易剖开，软骨组织致密而有光泽，4%多聚甲醛固定10 h，后用EDTA脱钙15 d，包埋切片约3～4 μm薄片，用HE染色，显微镜下观察对照组（图1、图2）大鼠股骨头骨组织与实验组（图3、图4）无明显损伤.

图1 对照组 骨小梁及髓腔结构 HE×100

图2 对照组 正常骨细胞及骨陷窝结构HE×200

图3 C1组骨小梁及髓腔结构HE×100

图4 C1组骨细胞及骨陷窝结构正常HE×200

2.2 可行性研究

取股骨头从中剖开，4%多聚甲醛固定10 h，后用EDTA脱钙15 d，包埋切片约3～4 μm薄片，免疫荧光显微镜下观察发现对照1、2组和A1、A2组未见表达，C1与其它3组对比有明显差异性（P＜0.01），见图5.

图5 各组荧光蛋白质粒表达情况

3 讨论

超声微泡造影剂主要成份是医用高分子聚合材料，这些材料以合成的可降解的聚合物体系为主，在体内能自然降解，没有明显毒副作用［15］.在本实验中，对照组和实验组大鼠无论从形态观察还是股骨头骨组织HE染色观察，均无明显差异（P＞0.05）.由此可以证明，超声微泡造影剂携免疫荧光蛋白质粒转染大鼠骨组织是安全的.

质粒+照射组、单纯质粒组、微泡携质粒+照射组以及单纯微泡携质粒组转染后都有蛋白表达，但微泡携质粒+照射组（C1组）表达最显著.可见，超声微泡造影剂携免疫荧光蛋白质粒转染大鼠股骨头是安全可行的.目前，骨科疾病的基因治疗正在广泛开展，但研究方向以基因较多，基因载体相对较少.利用超声微泡造影剂作为一种载体携基因质粒（如VEGF基因质粒）转染治疗骨科疾病（如股骨头坏死）的可行性，还需要进一步探讨.