鸡营养应激中SIRT1 基因对肝脏脂类代谢的影响

郁建锋，王中亮，张燕萍，胡 悦，徐 璐，龚道清，顾志良*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

SIRT1 是Sirtuins 家族的成员之一，其通过对蛋白质的去乙酰化作用参与蛋白质功能的调控[1-2]，如通过调节组蛋白和非组蛋白的活性进而调控基因转录，影响机体众多生物学过程[3-4]，如细胞的增殖凋亡、应激反应和能量代谢等[5-7]。小鼠SIRT1 通过对甾醇调节元件结合蛋白1 c（Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c，SREBP-1c）的去乙酰化作用抑制肝脏脂类合成基因的表达，如脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，FASN）等，避免肝性脂肪变性[8-10]。禁食或胰高血糖素增加可以上调SIRT1 基因的表达[11]，促进过氧化物酶体增殖活化的受体γ 协同激活因子1α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma Coactivator 1α，PGC-Lα）的去乙酰化，调控与糖代谢相关酶类的表达[12-14]，还可以提高过氧化物酶体增殖活化的受体α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α，PPAR α）的转录，增加小鼠肝脏的脂肪酸的β-氧化[15-16]，说明SIRT1 在脂肪酸氧化及脂类代谢过程起着重要作用。肝脏是鸡的主要能量代谢器官之一，在鸡的糖脂代谢方面具有重要作用，脂肪组织中80%以上的脂肪酸由肝脏的从头合成途径产生[17]。本研究将以广西三黄鸡为研究对象，研究营养应激、高糖高脂对肝脏中SIRT1 及相关基因表达的影响，探讨SIRT1 基因在鸡肝脏中脂类代谢中的重要作用及机理，从而为解决在饲养过程中鸡的脂类沉积问题提供新的、重要的依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品和试剂 RNA 提取试剂RNAsio、反转录试剂 盒PrimeScript ™ RT Reagent Kit （Perfect Real Time）、荧 光 定 量PCR 试 剂 盒SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、DL2000 购自宝生生物工程（大连）有限公司，棕榈酸（ Palmitic acid, PA）购自Sigma，山羊抗SIRT1 多抗（sc-19857）和小鼠抗β-actin 单抗（sc-47778）购自圣克鲁斯生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG（D110115）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG（ab97046）购自Abcam，Western/IP 裂解液和BeyoECL Plus A 液和B 液购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 引物设计和合成 根据NCBI GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）数据库中公布的鸡SIRT1（NC_00 6093.4）、β-actin（NC_006101.4）、PGC-Lα（NC_006091.4）、PPAR α（NC_006088.4）、三酰甘油脂肪酶（Adipose Triglyceride Lipase，ATGL）（NC_006092.4）、FASN（NC_006105.4）的基因序列设计定量引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1.3 禁食实验 选用30 只同批次的30 日龄雄性广西三黄鸡，随机分成A、B 和C 3 组，每组10 只。每组正常饲喂和饮水，温度维持在26～28℃，饲养4 d 后，A组（对照组）维持原有的进食、饮水，B 组和C 组进行禁食处理（饮水正常）24 h 后，将A 组和B 组的鸡称重后屠宰采样，颈动脉采血，并采集各组织，液氮速冻后，存放于-80℃冰箱。C 组恢复进食2 h 后，按上述方法进行屠宰采样，用全自动血液分析仪测定血清中的葡萄糖、甘油三酯（TG），每组分别测定10 个样本。

1.4 高糖、高脂对LMH- gSmiR30 细胞的作用 为进一步探究SIRT1 基因对鸡肝内脂代谢的作用，选用本实验室所构建的SIRT1 基因低表达的鸡肝癌细胞系LMH- gSmiR30，联合用葡萄糖和PA 处理该细胞系，以3×105/mL 的细胞将LMH-pmirG 细胞（对照组）和LMH-gSmiR30 细胞铺板于24 孔培养板内，每孔0.5 mL Waymouth′s 完全培养基（含10%胎牛血清，100 ng/mL的G418），37℃、5% CO2培养24 h，PBS 洗涤1 遍后，换成含10% 胎牛血清的MEM 完全培养基，在实验组中添加终浓度为50 mmol/L 葡萄糖和0.2 mmol/L PA，培养48 h 后，收集细胞，提取总RNA，每次设3 个重复，重复3 次实验。其余的细胞进行油红染色：弃培养基，PBS 洗涤1 次后，加入100% 的丙二醇作用2 min，去除丙二醇，加入0.5 mL 0.5%的油红（丙二醇配置的油红），60℃处理60 min；去除油红染料，加入85% 的丙二醇作用2 min，弃液后用流水洗3～5 min，晾干，甘油明胶封合，镜下检测。

1.5 总RNA 的提取及荧光定量分析 挑取适量的肝脏组织块和培养细胞，按RNAsio 试剂说明提取总RNA，用NanoDrop ND2000 进行定量后，用反转录试剂盒Prime Script ™ RT Reagent Kit（Perfect Real Time） 对RNA样品进行RT 反应合成cDNA；然后以β-actin 为内参，用荧光定量PCR 试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）对目标基因进行定量检测，体系：10 μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），0.4 μL Forward primer （10 μmol/L），0.4 μL Reverse primer（10 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye II（50×），2.0 μL 上述RT 产物稀释液，H2O 补足至20 μL；反应条件：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）40 个循环，PCR 反应结束后进行熔解曲线分析，收集数据进行统计分析。

1.6 SIRT1 基因的蛋白质表达水平的检测 挑取适量的肝脏组织块，用液氮碾磨后，用含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF）的Western/IP裂解液裂解组织和细胞，提取总蛋白，并用BCA（Bicinchoninic Acid）法测定总蛋白浓度。取35 μg总蛋白，以10% 的SDS-PAGE 进行蛋白质电泳分离，然后通过湿转法将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF），用含5% 脱脂奶粉的TBST（Tris Buffered Saline With 0.1% Tween-20，pH 7.4，TBST）缓冲液将PVDF 膜封闭过夜后，用TBST 充分漂洗（3次，每次10 min），然后在4℃条件下分别用山羊抗SIRT1 多抗TBST 以1∶250 稀释）和小鼠抗β-actin 单抗（TBST 以1∶250 稀释）孵育过夜；再次用TBST 充分洗涤PVDF 膜后，分别用辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG（TBST 按1∶20 000 稀释）和辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG（TBST 按1∶20 000 稀释），室温（21～25℃）孵育2 h；在TBST 充分洗涤PVDF 膜后，用等体积混合的BeyoECL Plus A 液和B 液混合液处理PVDF 膜进行曝光。

1.7 统 计分析 采 用2-ΔCt法对荧光 定 量PCR 结 果 进行分析，获得相关基因的表达结果，采用ImageJ 软件对Western blot 结果进行灰度分析，获得目标基因的蛋白表达水平，然后分别用t 检验和ANOVA 方差分析法对以上获得的数据分别进行组内、组间的统计分析。

2 结果与分析

2.1 禁食对鸡血清葡萄糖糖、血脂变化的影响 由表2可知，与A 组相比，B 组在禁食24 h 后的血清葡萄糖约为A 组的90%；C 组在禁食24 h 后恢复采食2 h，血清葡萄糖糖浓度迅速恢复至17.565 mmol/L，较A 组和B 组分别增加了14.3%和27.5%，3 组间的血清葡萄糖糖变化存在差异显著（P＜0.01）。B 组鸡在禁食24 h后血液中TG 显著下降至A 组的20% 左右，C 组恢复2 h 采食后TG 迅速升至A 组的50%左右（P＜0.01）。上述结果表明，在鸡禁食过程中，血液中的TG 变化程度比葡萄糖变化程度更明显。

表2 禁食对鸡血糖和TG 浓度的影响（n=10） mmol/L

2.2 饥饿对鸡肝脏SIRT1 及糖脂代谢相关基因的表达影响 表3 和图1 显示，与A 组相比，B 组中SIRT1基因的mRNA 水平增加了1.27 倍（P＜0.01），SIRT1蛋白水平增加了87.4%（P＜0.05），C 组中SIRT1 的mRNA 和蛋白质水平均显著下降，甚至低于A 组。进一步分析发现（表4），PGC-Lα、PPAR α 和ATGL 的mRNA 转录水平的变化趋势与SIRT1 基因基本一致，禁食后，分别增加了7.77、1.46、2.26 倍（P＜0.01），恢复采食2 h 后，PGC-Lα、PPAR α、ATGL 基因的mRNA水平也迅速降至A 组水平。而FASN 基因mRNA 水平的变化与SIRT1 基因相反，禁食后显著降低至A 组的1/13 左右（P＜0.01），恢复采食后回升至A 组的1/4（P＜0.01）。以上基因的表达变化与血液中葡萄糖和TG 浓度的变化相对应，这暗示SIRT1 及其他基因在鸡禁食过程中对肝脏的糖脂代谢反应起着重要作用。

2.3 高糖、高脂对肝细胞内SIRT1 及其下游基因表达的影响 油红染色结果显示，与LMH-pmirG 细胞相比，LMH- gSmiR30 细胞经50 mmol/L 葡萄糖和0.2 mmol/L PA 处理48 h 后，其胞内的脂滴形成更为明显（图2）。荧光定量结果显示，SIRT1、PPAR α 和FASN 基因的mRNA 表达水平在LMH-pmirG 和LMH-gSmiR30 细胞中均受到不同程度抑制（表5），但在2 种细胞间差异不显著。高浓度的葡萄糖和PA 抑制了ATGL 在LMH- gSmiR30 中mRNA 表达水平，但在LMH-pmirG 中未受到明显影响，说明SIRT1 基因的低表达抑制了LMH细胞中ATGL 对高糖高脂的应答表达，致使细胞内脂解反应减少。因此，LMH- gSmiR30 细胞在高糖高脂的培养条件下更易在细胞内形成脂滴。

表3 禁食后鸡肝脏中SIRT1 基因的表达

图1 禁食后鸡肝脏中SIRT1 蛋白的Western blot 检测结果

表4 禁食后鸡肝脏内糖脂代谢相关基因mRNA 表达水平（n=8）

图2 细胞内脂滴的油红染色结果

表5 高糖、高脂对LMH-gSmiR30 细胞系中SIRT1 及糖脂代谢相关基因mRNA 表达水平的影响（n=3）

3 讨 论

肝脏是动物体最主要的代谢器官之一，在营养、能量平衡调节中起着最为重要的作用[15,18]。研究发现，尽管鸡的血糖值在禁食24 h 后有所下降，且恢复饲喂后快速回升，但血糖浓度在一个相对小的范围内上下波动，而TG 的变化非常明显，禁食24 h 后血脂的浓度明显低于正常饲喂组，恢复采食后血脂浓度虽然也低于正常组，但比禁食组回升明显，这些指标的变化与肝脏在禁食过程中发挥的作用密不可分，肝脏在机体禁食阶段可以通过肝糖原的动员产生葡萄糖，补充降低的血糖浓度，增加脂类的分解和促进脂肪酸的氧化代谢，满足机体对能量的需求[19]。

肝脏中的糖脂代谢相关基因的表达在禁食24 h 后都发生了不同程度的变化，这也印证了以上推断，如SIRT1、PGC-Lα、PPAR α 和ATGL 等 基 因 的mRNA 水平表达显著增加，恢复饲喂2 h 后又快速下降，且这4 个基因的变化趋势相一致。研究报道，在肝脏的糖异生中，SIRT1、Pgc1α 有着重要作用[20-21]，SIRT1 在表达水平和蛋白修饰水平参与PGC-Lα 基因功能的调节。在小鼠中，特异性敲低SIRT1 基因的表达后，PGC-Lα的表达显著减少，其调控的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶的表达也明显减少，如果小鼠PGC-Lα 中的第13 位上的赖氨酸突变为精氨酸，可以抑制其被乙酰化，而血糖则将会大幅升高，特别是在短期禁食期间，这种效应更为明显[15]。因此，禁食24 h 后SIRT1、PGC-Lα 基因的表达升高可能促进了鸡肝糖原的分解产生葡萄糖，补充血循环中的葡萄糖，缓解短期禁食造成的血糖变化。

而禁食24 h 后TG 大幅减少，这可能与机体通过增加脂肪酸的氧化和抑制脂类合成有关。SIRT1-PGCLα- PPAR α 与脂肪酸的氧化代谢密切相关，在脂类代谢中也发挥着重要作用[15-16]，SIRT1、PGC-Lα 和 PPAR α 基因在鸡禁食后的表达迅速升高可能是造成其血液中TG 大幅减少的原因之一。同时，ATGL 基因在禁食后的表达也显著升高。有研究发现，ATGL 可以对肝脏脂滴进行脂降解，产生脂肪酸，促进PGC-Lα/PPAR α 的信号通路，增加脂肪酸的氧化和线粒体生物反应[22]，ATGL 还可以通过SIRT1 引起肝脏脂滴的自噬和脂解，小鼠肝脏特异性敲除ATGL 基因可以导致脂肪在肝脏内的堆积，同时下调SIRT1 的活性及PPAR α/PGC-Lα 靶基因的表达和下调线粒体的生物反应及β-氧化[23]，这可能也是在禁食后鸡血液中TG 显著降低的原因。本研究还发现，在LMH-gSmiR30 中，SIRT1 基因的低表达导致ATGL 基因的表达有所下调，而且高浓度的葡萄糖和PA 可以加重这一反应，说明SIRT1 基因表达的减少抑制了ATGL 基因对高糖、高脂的应答性表达，减弱了肝细胞对脂肪的脂解作用[24]，而FASN 基因在LMH-pmirG 和LMH-gSmiR30 细胞中均受到高糖高脂的抑制，两者之间表达差异不明显，说明在高富营养的培养条件下LMH 细胞中脂滴形成增加，而LMHgSmiR30 胞内的脂滴形成更多的原因是由于SIRT1 基因细胞中的低表达降低胞内脂解代谢水平，而非通过增加脂类的合成造成的。由此可见，SIRT1-ATGL 在鸡肝或肝细胞内脂类的分解中可能发挥着重要作用。

4 结 论

综上所述，鸡SIRT1 基因的表达量与肝内的糖脂、能量代谢密切相关，禁食和能量限制可以增加SIRT1基因的表达；富营养条件下，LMH 细胞中SIRT1 基因的低表达降低了ATGL 基因的表达，影响肝细胞内脂肪的脂解途径，促进胞内脂滴的增加。