旱半夏叶柄无菌接种条件的优化*

喻 娜 （广安职业技术学院 四川广安 638000）

旱半夏（Pinellia ternata）又叫地文、麻芋子等，是天南星科多年生宿根草本植物， 广泛分布在我国各地，常见于草坡、荒地、玉米地，以地下块茎入药，是一种重要的中药材，其性温、辛辣且刺激性强、有小毒，经炮制后有燥湿化痰、降逆止呕等功效［1－3］。 在最近的研究中发现，旱半夏提取物在植物病原防治方面也有很好的效果［4］。

旱半夏在自然界通过珠芽与块茎进行无性繁殖，也可通过种子进行有性繁殖，但旱半夏种子的结实率较低， 因此在自然界主要依赖无性繁殖的方式存活。虽然旱半夏在自然界易于存活，但环境中的温度、光照、土壤、水分等条件对旱半夏的生长影响较大；生长缓慢，易感染病毒，采集困难，也导致旱半夏的广泛人工栽种比较困难。 目前开垦荒地、农药化肥的滥用、环境污染等原因导致野生的旱半夏生长环境受到了破坏， 以致旱半夏品质下降，野生资源减少，因此旱半夏在我国中药材市场出现了供不应求的现象［5］。 对旱半夏的植物组织培养技术进行研究， 可通过人工化学诱变提高自然突变率创新品种［6］，同时为提高人工栽培旱半夏的品质及产量提供理论基础和技术支持。

本实验以旱半夏的叶柄作为外植体， 建立无菌播种的优化条件，为旱半夏的组织培养、快速繁殖应用、新品种培养研究及生理研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验所用的旱半夏叶柄采自四川广安地区的野生旱半夏，5月份采集当年生的幼嫩叶柄，剪成2 cm 左右长度。

1.2 方法

1.2.1 70%酒精对叶柄的消毒效果实验 70%酒精处理不同时间对叶柄的消毒效果的影响实验，选用基本培养基MS 培养基， 将剪好的叶柄置于超净工作台，70%酒精处理30 s、45 s、50 s， 无菌水分别冲洗3～5 次，2% NaClO 浸泡15 min，无菌水冲洗3～5 次，接种于培养基，每瓶接种5～8 段，实验重复3 次，接种后的第5 天统计污染率，接种后的第20 天统计褐化情况和玻璃化情况。

1.2.2 H2O2对叶柄的消毒效果实验 不同浓度的H2O2处理不同时间对叶柄的消毒效果的影响实验，选用基本培养基MS 培养基，将剪好的叶柄置于超净工作台，70%酒精处理45 s，无菌水冲洗3～5 次，分别用3%、6%、9%的H2O2浸泡6 min、9 min、12 min， 无菌水冲洗3～5 次， 接种于培养基，每瓶接种5～8 段，实验重复3 次，接种后的第5 天统计污染率，接种后的第20 天统计褐化情况和玻璃化情况。

1.2.3 NaClO 对叶柄的消毒效果实验 不同浓度的NaClO 处理不同时间对叶柄的消毒效果的影响实验，选用基本培养基MS 培养基，将剪好的叶柄置于超净工作台，70%酒精处理45 s， 无菌水冲洗3～5 次， 分别用2%、4%、6%的NaClO 浸泡9 min、12 min、15 min，无菌水冲洗3～5 次，接种于培养基，每瓶接种5～8 段，实验重复3 次，接种后的第5 天统计污染率，接种后的第20 天统计褐化情况和玻璃化情况。

1.2.4 新洁尔灭对叶柄的消毒效果实验 不同浓度的新洁尔灭处理不同时间对叶柄的消毒效果的影响实验，选用基本培养基MS 培养基，将剪好的叶柄置于超净工作台，70%酒精处理45 s，无菌水冲洗3～5 次，分别用0.5%和1%的新洁尔灭浸泡8 min、10 min、12 min， 无菌水冲洗3～5 次，接种于培养基，每瓶接种5～8 段，实验重复3 次，接种后的第5 天统计污染率，接种后的第20 天统计褐化情况和玻璃化情况。

1.3 数据统计与分析

污染率（%）=（污染的叶柄段数/接种叶柄段数）×100%。

褐化情况中的无、较轻、轻度、较严重、严重分别表示其褐化率=0、0＜褐化率≤25%、26%＜褐化率≤50%、51%＜褐化率≤75%、76%＜褐化率≤100%。 其中，褐化率（%）=（褐化的叶柄段数／接种叶柄段数）×100%。

玻璃化情况中的无、较轻、轻度、较严重、严重分别表示其玻璃化=0、0＜玻璃化率≤25%、26%＜玻璃化率≤50%、51%＜玻璃化率≤75%、76%＜玻璃化率≤100%。 其中，玻璃化率（%）=（玻璃化的叶柄段数/接种叶柄段数）×100%。

2 结果分析

2.1 70%酒精对叶柄的消毒效果 70%酒精处理不同时间对叶柄的消毒效果的影响（表1），70%酒精处理时间越长污染率越低，褐化现象越严重，70%酒精处理45 s 以上污染率为0，但处理50 s时褐化现象就很严重；70%酒精处理时间越短，污染率越高，玻璃化越严重。在70%的酒精处理45 s，再用2% NaClO 浸泡15 min 是最佳灭菌条件。

表1 70%酒精处理不同时间对旱半夏叶柄消毒的影响

2.2 H2O2对叶柄的消毒效果 旱半夏叶柄用70%酒精处理45 s 后， 用浓度为3%、6%、9%的H2O2浸泡6 min、9 min、12 min 进行消毒（表2），6% H2O2处理旱半夏叶柄的效果较好， 低浓度H2O2处理污染率较高，材料容易玻璃化，高浓度H2O2处理材料褐化严重。 在70%的酒精处理45 s后，6% H2O2处理6 min 时，污染率为0，玻璃化较轻，无褐化现象，灭菌效果较好。

表2 不同浓度的H2O2 处理不同时间对旱半夏叶柄消毒的影响

2.3 NaClO 对叶柄的消毒效果 旱半夏叶柄用70%酒精处理45 s 后， 用浓度为2%、4%、6%的NaClO 对旱半夏叶柄进行消毒（表3），2%的NaClO处理15 min，4%的NaClO 处理9 min 和12 min，材料都没有污染、褐化和玻璃化现象出现，从整体上看NaClO 处理的污染率较低， 玻璃化和褐化现象较少， 可以看出NaClO 较适合处理旱半夏叶柄，消毒效果较好。

表3 不同浓度的NaClO 处理不同时间对旱半夏叶柄消毒的影响

2.4 新洁尔灭对叶柄的消毒效果 旱半夏叶柄用70%酒精处理45s 后， 用0.5%和1%的新洁尔灭对旱半夏叶柄进行消毒（表4）。 不同浓度的新洁尔灭处理的污染率都较高， 玻璃化和褐化现象较严重，可以看出新洁尔灭的消毒效果不太理想。

表4 不同浓度的新洁尔灭处理不同时间对旱半夏叶柄消毒的影响

3 讨论

在本实验对叶柄消毒条件的处理设计中，消毒剂的种类、 浓度和处理时间对旱半夏叶柄的污染率、褐化和玻璃化现象都有影响（图1）。在70%的酒精处理45s 后，6% H2O2处理6 min 时， 无污染，玻璃化较轻，灭菌效果较好；2%的NaClO 处理15 min，4%的NaClO 处理9 min 和12 min， 材料没有污染、褐化和玻璃化现象，是最佳无菌条件。从整体看，NaClO 的处理效果比H2O2和新洁尔灭的处理效果好， 建议实践中用NaClO 消毒旱半夏叶柄。 本实验初步探索了旱半夏叶柄的无菌播种条件，为旱半夏的进一步研究提供基础。

图1 消毒剂对外植体的影响