微小RNA-144在活动期肺结核病人外周血中的表达水平及临床意义

周冰，徐岩松，侯丽丽，谢耀萍，付鹏

肺结核又称为痨病，是由结核分枝杆菌感染导致的慢性炎性疾病，全球病人数量每年以数百万的速度增加，由于结核杆菌感染而导致死亡的人数在感染性疾病中居第二位[1-2]。同时有些病人感染结核杆菌后并不会立即发病，当机体的免疫力下降或变态反应增强时，才表现出肺结核症状，全世界范围内有1/3的人的结核分枝杆菌处于潜伏感染期[2-3]。中国有近50%的人感染结核杆菌，结核杆菌已成为肺结核新发病例的主要病原菌，因此对肺结核病人进行早期的诊断和治疗具有重要意义[4]。目前临床上诊断方法主要包括细菌学检测、细胞因子检测、抗原检测等，但是这些方法具有耗时长，可能出现假阴性，对样品要求高等缺点，会干扰肺结核的及时诊断和治疗[1，5]。近年来的研究发现，微小RNA(micro RNA，miRNA)在结核病病人外周血中稳定存在，其表达水平会升高或者降低，参与肺部疾病的发生及发展，能够调控基因表达，作为新的生物标志物成为研究热点[6]，随着对miRNA的研究不断深入，有研究[4]证实微小RNA-144(mir-144)的表达水平与宿主的免疫功能联系密切，但其临床意义并未深入研究。本研究通过检测活动期肺结核病人外周血中mir-144的表达水平及临床意义，旨在为临床诊断活动期肺结核提供新的方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016年1月至2017年4月哈尔滨医科大学附属第一医院核医学科收治的活动期肺结核病人98例，所有病人胸部X线扫描发现病灶，并经细菌学诊断均呈阳性。纳入标准：①年龄>18岁；②临床资料完整，且依从性高；③经病人及其近亲属同意，并签署知情同意书。排除标准：①合并心、肝、肾脏器病变；②患有糖尿病、甲状腺功能亢进、类风湿关节炎等全身免疫性疾病；③入组前曾使用影响免疫功能的药物；④中途退出的病人。活动期肺结核组中男69例，女29例；年龄(50.23±6.02)岁，年龄范围为26～75岁；体质量指数(22.08±1.25)kg/m2，体质量指数范围为19.87～24.62 kg/m2；病程为(3.02±1.17)个月，病程范围为1～6个月。另外选择同期进行体检的健康志愿者62例作为对照组，其中男40例，女22例；年龄为(50.09±5.65)岁，年龄范围为25～73岁；体质量指数为(21.97±1.13)kg/m2，体质量指数范围为19.43～24.67 kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，研究过程均符合相关规定。

1.2 方法

1.2.1样品收集及RNA提取 受试者均空腹抽取外肘静脉血2 mL，置于涂有肝素钠的采血管中，30 min内将200 μL全血装入含有Trizol 和研磨珠的冻存管中，充分振荡均匀后，置于-80 ℃冰箱中备用待测。参照Trizol Reagent试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书提取血液中总RNA，使用适量核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)水充分溶解RNA，应用核酸测定仪检测浓度和纯度，RNA的完整性检测使用琼脂糖凝胶电泳分析，调整其浓度后，置于 -80 ℃冰箱中保存。

1.2.2荧光定量PCR 应用反转录试剂盒(德国QIAGEN有限公司)将RNA反转录为cDNA，取20 μL待测样品，包括1 μL总RNA，分别取5份反转录缓冲液4 μL、1份反转录酶1 μL和4份RNase水14 μL，在37 ℃下反应1 h，然后在95 ℃下反应5 min。mir-144引物序列为5′-ATCCAGTGCGTGTCGTCGTG-3′(由上海生工生物工程有限公司设计合成)，具体的条件：在95 ℃下预变性5 min；变形和延伸的温度为95 ℃，时间为5 s；60 ℃反应20 s；72 ℃反应20 s，共计40个循环；78 ℃下反应20 s进行荧光收集。内参为管家基因U6，采用相对定量法计算外周血中mir-144的相对表达水平。

1.2.3血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达水平检测 受试者均空腹抽取外肘静脉血3 mL，置涂有肝素钠的采血管中，以3 500 r/min的速度离心10 min，离心半径为3 cm，分离上清液，即得血浆。采用酶联免疫吸附测定法检测血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照说明书进行操作。

1.3 观察指标比较血液中mir-144和血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平，另外分析活动期肺结核病人血液中mir-144的表达水平和血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平的相关性。根据研究数据绘制血浆mir-144诊断活动性肺结核的受试者工作特征曲线(ROC)，计算曲线下面积，用最大约登指数法确定血浆mir-144诊断活性期肺结核的的截断值，计算用此截断值诊断活动性肺结核的灵敏度和特异度。

2 结果

2.1 血液中mir-144和血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平的比较活动期肺结核病人血液中mir-144的表达水平明显低于对照组，而血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组mir-144、TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平的比较

2.2 血液中mir-144和血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平的相关性活动期肺结核病人血液中mir-144的表达水平与血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平呈负相关(r=-0.718、-0.709、-0.723，P=0.019、0.022、0.018)。数据散点图见图1。

图1 血液中mir-144和血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平的相关散点图

2.3 mir-144的诊断意义根据本研究数据绘制血浆mir-144诊断活动性肺结核的ROC曲线(图2)，曲线下面积为0.944，用最大约登指数法确定血浆mir-144诊断活性期肺结核的截断值为1.47，用其诊断活动性肺结核的灵敏度和特异度分别为96.88%(155/160)和96.77%(60/62)。

图2 血浆中mir-144诊断活动性肺结核的ROC曲线

3 讨论

结核分枝杆菌作为细胞内致病菌，其宿主一旦被感染，激活信号传导通路，抑制机体的免疫应答反应，结核分枝杆菌与Toll样受体作用，通过激活多种信号通路而发挥抗炎及抑菌效应[7]。结核分枝杆菌通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路而上调TNF-α、IL-10及MCP-1的合成量，前炎性因子激活巨噬细胞，加强其吞噬作用，杀死病菌，提高抗结核的活性，结核的免疫类型主要为巨噬细胞参与的细胞免疫过程，结合感染的过程中巨噬细胞产生特异性miRNA，并且在肺结核病人血液中检测到miRNA[8-9]。miRNAs由21～25个核苷酸组成，主要在哺乳动物的细胞内表达，转录后调节基因表达，虽然在人类基因总数中占比不足5%，但是却可以调控超过30%的基因。

miRNAs参与胚胎发育、细胞增殖分化和细胞凋亡和死亡等过程，同时miRNA对免疫细胞分化、信号传导及免疫应答等免疫反应的多层面能够进行精细调节[6，10]。血液中miRNAs能够作为多种疾病如胃癌等的生物学早期诊断指标，目前对于 mir-144的研究主要集中在血液系统疾病上，对于炎性疾病，尤其是结核病的研究并不多见[6，11]。另外潜伏期肺结核的细菌实验呈阳性，但是影像学检查结果与正常人差异无统计学意义，有超过85%的活动期肺结核病人是由潜伏期肺结核演变来的，因此准确判断潜伏期的肺结核对于预防和控制活动期肺结核具有重要意义[5]。

在哺乳动物体内的非编码RNA主要包括短小RNA、miRNA及小分子RNA等[12-13]，miRNA在临床样本中的稳定性高，并且可以快速准确定量，有望成为非创伤性生物学指标来反映疾病的发生及发展过程，miRNA目前已经被广泛应用于心脏病、糖尿病及感染性疾病中[3，13-14]。miRNA来源于内源性染色体，由长度为70～80核苷酸的单链RNA组成的短序列，其存在形式分为单拷贝、多拷贝或基因簇，并且多存在于基因间隔区，独立性较强，不能翻译成蛋白质，主要是通过降解对应mRNA影响蛋白质的表达水平，调控机体的代谢过程[5]。结核分枝杆菌通过影响miRNA的表达水平影响细胞因子和免疫应答反应，检测结核病人血清中1 223种miRNA的表达水平，其中59种miRNA表达水平升高，而33种miRNA表达水平降低，提示miRNA对于评价结核病的诊断及治疗效果具有重要作用[3]。

研究结果中发现，活动期肺结核病人血液中mir-144的表达水平明显低于对照组(P<0.05)，说明mir-144能够用于反映肺结核的发生和发展，另外血浆mir-144诊断活动性肺结核的ROC曲线下面积为0.944，截断值为1.47，同时诊断活动性肺结核的灵敏度和特异度分别为96.88%和96.77%，提示使用mir-144诊断活动期肺结核意义重大。机体感染结核杆菌后，机体产生相应的免疫反应，导致细胞因子等物质的释放，主要包括TNF-α、IL-10及MCP-1，对于结核病的发生及发展具有重要作用，TNF-α、IL-10及MCP-1是体内促炎因子，影响活动性肺结核，从而清除结核分枝杆菌的病原体[7，16]。结果表明活动期肺结核病人血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平明显高于对照组病人，说明结核杆菌激活机体的免疫防御机制，上调细胞因子的释放量。相关性研究结果表明血液中mir-144的表达水平与血浆中TNF-α、IL-10及MCP-1表达水平呈负相关(P<0.05)。mir-144主要在T淋巴细胞中表达，调节细胞免疫过程[10]，有研究证实[17]，mir-144在活动性肺结核病人的外周血单个核细胞的表达水平高于健康志愿者，可能是通过抑制淋巴T细胞增殖调节抗结核免疫反应。另外miRNA主要影响MAPK和NF-κB等信号通路，结核杆菌可能通过miRNA调控的信号通路，抑制机体的免疫应答，感染性疾病的机体内的病毒通过基因沉默机制“逃脱”免疫系统的监控，依赖miRNA抵抗机体的免疫反应[5，7]。

综上所述，活动期肺结核病人外周血中mir-144的表达水平异常降低，并且与TNF-α、IL-10及MCP-1呈负相关，临床诊断价值高，为今后研究活动期肺结核的预防和诊断提供新的思路和方法。