ERCC1 Asn118Asn(rs11615)和ERCC2 Lys751Gln(rs13181)基因多态性与胆囊癌的关联性研究

幸赞西,包昶宇

胆囊癌在临床中较为少见，但恶性程度高。胆囊癌一般早期不易被发觉，并且容易发生转移，对化疗药物不敏感。因此，临床治疗胆囊癌的常见方法是手术治疗，早期手术能够明显提高病人预后，但研究表明胆囊癌病人术后的生存率为32%～61%，并且复发率高[1]。细胞内DNA损伤与核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)机制密切相关，NER的能力可以明显改善肿瘤病人的预后[2]。研究发现骨肉瘤病人及正常人群(ERCC)基因ERCC1Asn118Asn(rs11615)和ERCC2Lys751Gln(rs13181)在NER机制中具有重要功能。本次研究针对ERCC1和ERCC2基因多态性，探究其与胆囊癌病人预后的关系，旨在为同行提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择重庆市红十字会医院普外科2014年5月至2016年5月期间收治的50例胆囊癌病人为胆囊癌组，其中男性32例，女性18例，年龄范围为45～68岁，年龄为(52.6±4.2)岁；另选择50例同期健康体检人员为对照组，其中男性35例，女性15例，年龄范围为42～64岁，年龄为(49.3±3.8)岁。胆囊癌组与对照组在年龄和性别方面差异无统计学意义(t=0.323，P=0.754；χ2=0.534，P=0.764)，具有可比性。胆囊癌组病理类型：腺鳞癌4例、未分化癌3例、腺癌36例、鳞癌7例。胆囊癌Nevin分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期15例，Ⅲ期6例，Ⅳ期6例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求,征得病人或其近亲属同意并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1基因组DNA提取 利用QIAGEN试剂盒(QIAamp DNA Blood MiniKit，USA,批号52304)提取肝素抗凝管内静脉血的DNA。

1.2.2引物合成ERCC1与ERCC2基因正向和反向的引物合成序列见表1，引物由北京华博生物技术有限公司合成。

1.2.3聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增 预变性95 ℃4 min、变性95 ℃30 s、退火56 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，72 ℃末延伸5 min；共35个循环，重蒸水(ddH2O)17 μL，PCR产物10 μL;水浴37 ℃酶切10 min，然后取出立即置水浴65 ℃灭活5 min；使用2%琼脂糖凝胶，电泳45 min，电压设置为145 V。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件。计数资料用例(%)表示，各组间基因型和等位基因频率比较采用Hardy-Weinberg检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分型结果在ERCC1Asn118Asn(rs11615)中，对照组CC型33例，CT型13例，TT型4例；胆囊癌组CC型27例，CT型13例，TT型10例。在ERCC2Lys751Gln(rs13181)中，对照组AA型28例，AB型16例，BB型6例；胆囊癌组AA型10例，AB型22例，BB型18例。

2.2 ERCC基因型在胆囊癌组与对照组的分布由表2结果表明，两组的ERCC1Asn118Asn(rs11615)的基因型频率分布相比，差异有统计学意义(χ2=7.05，P=0.028)。两组的ERCC2Lys751Gln(rs13181)的基因型频率分布相比，差异无统计学意义(χ2=0.83,P=0.669)。ERCC1Asn118Asn(rs11615)的胆囊癌组与对照组等位基因频率分布比较，差异有统计学意义(χ2=5.27，P=0.026)。ERCC2Lys751Gln(rs13181)的胆囊癌组与对照组等位基因型频率分布比较，差异无统计学意义(χ2=0.75，P=0.448),结果见表3。

表2 ERCC1与ERCC2基因型频率分布/例(%)

表3 ERCC1与ERCC2等位基因频率分布/个(%)

2.3ERCC1、ERCC2多态性与胆囊癌的关系分析两个基因的基因型与胆囊癌的关系时发现,ERCC1的T与C等位基因比较，差异有统计学意义(χ2=6.31，P=0.004)，而ERCC1的TT与CC基因型比较，差异有统计学意义(χ2=5.82，P=0.032)。ERCC2的AB与AA基因型比较，差异有统计学意义(χ2=5.31，P=0.025)，见表4。

3 讨论

核苷酸切除修复(NER)作为修复DNA的途径之一，可以为多重DNA损伤提供有效地修复帮助，同时也满足体现出高度多态性的DNA损伤修复需要[3]。采用NER途径可以对DNA、紫外线损伤起到高效地修复作用。但是研究也表明，借助该类途径进行治疗的病人，其体内的ERCC1和ERCC2基因多态性在某种程度上会影响NER相关功能的发挥[4]。已有临床研究中，大多数围绕ERCC1基因展开的分析都是基于118位置C到T突变的这一层面[5-6],比如，相关研究人员选取了一部分非小细胞肺癌病人，并对这些病人体内的ERCC1 Asn118Asn展开了相关分析，分析结果显示，部分体内检测出CC基因型的病人(54/109,50.4%)生存时间大多为486 d左右(95%CI:333～523)，而变异型CT(45/109,42.1%)或TT(8/109,7.5%)生存时间则有了大幅度的缩小，时间多数为281 d(95%CI：214～376)，两者差异有统计学意义(P=0.005 8)[5]。这直接说明了随着DNA复和物清除数量的持续增加，顺铂耐药性随之改变，ERCC1和ERCC2水平也会发生变化。诸多资料都显示NER基因会影响消化道肿瘤[7]、肺癌[8]、口腔癌[9]等病症的病发和后续演变，同时会对病人临床治疗效果、后续细胞修复产生影响作用。但是有关胆囊癌NER基因的探讨及相关文献却少之又少。

表1 ERCC1与ERCC2基因引物设计

表4 ERCC1和ERCC2基因多态性与胆囊癌的关系

结合分析结果可知，ERCC、ERCC1Asn118Asn(rs11615)、等位基因在分布上体现出一定的规律，且三种基因都指向胆囊癌这一病症。除此之外，ERCC2Lys751GlnAB也同其病发存在关联性。由此可以推断出ERCC的基因多态性可以在一定程度上判定胆囊癌的发生，是细胞癌变和扩散的警示之一。在本研究中，笔者只围绕ERCC1和ERCC2、等位基因展开其同胆囊癌病变的研究。随着后续研究的深入，可以适当对样本数量加以丰富化。从肿瘤细胞层面来说，其体现出来的DNA修复水平较高，这样一来便会直接导致癌细胞数量的迅速增长，从而弱化了药物的效用，不利于病人的治疗。所以，如何准确而高效地对癌细胞进行标记和检测控制，是评估和治疗胆囊癌期间需要加以重点考虑的问题。借助检测基因多态性的早期控制可以帮助医生更好地了解病人体内癌细胞的分布和增长情况，有助于病情的尽早控制。研究结果显示ERCC1和ERCC2这两个基因在一定程度上会影响胆囊癌的病发，主要两者体现的多态性。另外ERCC1Asn118Asn(rs11615) TT、等位基因T和ERCC2Lys751Gln(rs13181) AB三者都会促使该癌症的病发，这一特征可以运用到临床检测胆囊癌方面，以此来缩短胆囊癌检测的时间跨度，为病人争取更多的治疗时间，提高治疗效果。

综上所述,胆囊癌病人肿瘤细胞中的ERCC1与ERCC2多态性与胆囊癌发生显著相关,检测其多态性对早期发现胆囊癌有一定价值。