PCBP1对6-OHDA作用的SH-SY5Y细胞凋亡影响的研究

贾冰冰 霍丽蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)主要发生在中老年时期，是一种常见的神经系统退行性疾病，病理上主要表现为黑质多巴胺能神经元的缺失死亡，纹状体内多巴胺含量减少，路易小体形成。许多研究认为，基因和环境的改变均可导致PD的发生，但神经元细胞死亡的具体机制目前尚不清楚[1]。有研究显示，将6-OHDA注射入纹状体内，黑质多巴胺能神经元细胞可出现凋亡和坏死等形态学改变，因此6-OHDA是与PD发病有关一种神经毒素[2]。多聚胞嘧啶结合蛋白1[poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]，是细胞内的一种桥梁蛋白质，PCBP1于哺乳动物的各组织中广泛分布，PCBP1可参与mRNAs-蛋白复合体的形成及其他多种生物学过程[3]。为了进一步探讨毒素作用下的神经元细胞周期是否受到PCBP1的调控作用，应用脂质体转染的方法将PCBP1全长cDNA的重组质粒转染SH-SY5Y细胞系，研究在神经毒素6-OHDA作用下,PCBP1对SH-SY5Y细胞周期变化的影响。

材料与方法

1.材料及试剂：SH-SY5Y细胞由北京儿童医院儿科研究所惠赠；含PCBP1序列的重组质粒(本室构建保存)；胎牛血清、1%青/链霉素、1640培养液、小提质粒试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ、TagDNA聚合酶、LipHigh脂质体高效转染试剂均为上海生物工程有限公司产品；反转录试剂盒(天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索莱宝生物科技有限公司)；AnnexinV/PI双染凋亡试剂盒(四正柏生物公司)；6-OHDA(美国Sigma公司)；流式细胞仪(美国BD Calib公司),倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

2.重组pEGFP/N1-PCBP1质粒构建和鉴定：采用PCR扩增PCBP1目的序列，引物含有EcoRⅠ酶切位点，pcbp1的PCR扩增引物：TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG和TTCTAGAATTCA-ACCTACACTGTTCTAGCTGCACC；应用PCR反应混合物：模板<1μg，上下游引物(10μmol/L)各2μl，2×Master Mix 25μl，加水补足至50μl。PCR反应循环设置：94℃，4min；再设30个循环:94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；最后72℃，5min。之后将PCR产物纯化、EcoR酶I切后与质粒pEGFP-N1连接，转化大肠杆菌Dh5α。通过克隆筛选，扩增，经测序证明PCBP1正确重组到pEGFP/N1质粒上。

3.SH-SY5Y细胞培养及转染：取对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×106个/ml接种于60mm细胞培养皿中，于含1%青霉素和链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2培养箱中进行培养，待细胞生长至密度接近70%～80%时，将细胞培养液更换为不含抗生素的培养基。取4μg pEGFP/N1-PCBP1(实验组)或pEGFP/N1质粒(对照组)滴加至250μl的1640培养基，同时将10μl的脂质体滴加250μl的1640培养基，缓慢混匀，室温静置5min后，将两种质粒混合物分别加入脂质体混合物中，缓慢混匀后室温静置20min，形成两种转染工作液。将上述转染工作液逐滴加入细胞培养基中，于培养箱中继续培养8h后，更换为含抗生素的完全培养基。于瞬时转染24h时，在倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达。

4.6-OHDA作用于两组细胞：将SH-SY5Y细胞以1×105/ml密度接种到12孔板内，每孔1ml；细胞生长至密度70%～80%时，细胞饥饿处理后分别将pEGFP/N1-PCBP1质粒(实验组)和pEGFP-N1质粒(对照组)按照前述方法转染SH-SY5Y细胞。转染24h时，分别将终浓度为5、15、25μmol/L的6-OHDA滴加到实验组和对照组SH-SY5Y细胞中，继续培养24h；另将终浓度为25μmol/L的6-OHDA滴加到实验组和对照组细胞中，继续培养4、8、24h后进行流式检测。

5.细胞周期检测：将不同处理组的细胞收集到离心管内，5min，1000×g离心；弃上清，向离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，弃上清；用1×结合缓冲液重悬细胞，取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE混匀后于室温避光孵育5min；加入7AAD 10μl，并加入500μl PBS,进行流式检测。

结 果

1.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1鉴定：根据载体质粒特征性限制性酶切位点的位置，用EcoR I进行酶切后，理论上应产生4700和1070bp两个片段。经限制性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1显示，重组质粒大小、酶切片段大小和理论值一致，经测序鉴定PCBP1 cDNA序列插入正确。

图1 EcoR Ⅰ酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析M.Maker；1.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1 EcoRⅠ酶切产物电泳；2.空载质粒pEGFP-N1 EcoRⅠ酶切产物电泳

2.6-OHDA对转染PCBP1重组质粒和空载质粒的细胞凋亡的影响：将不同浓度6-OHDA 作用于两组SH-SY5Y细胞不同时间后，流式细胞仪分析结果显示，5、15、25μmol/L 6-OHDA对实验组和对照组细胞作用24h后，转染PCBP1重组质粒的细胞早期凋亡率低于转染空载质粒组，差异有统计学意义(表1，图2，P<0.05)；转染PCBP1重组质粒和转染空载质粒的细胞晚期凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。25μmol/L 6-OHDA分别对实验组和对照组细胞作用8、16、24h后(表2，图3)， 转染PCBP1重组质粒的细胞早期凋亡率低于对照组细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；转染PCBP1重组质粒和空载质粒的细胞晚期凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同浓度6-OHDA分别对实验组和对照组作用24h后细胞凋亡率比较

对照组为转染空质粒pEGFP/N1的SH-SY5Y细胞；实验组为转染重组质粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y细胞。实验组与对照组比较，P<0.05

讨 论

近年来，细胞凋亡分子机制相关研究表明，多巴胺神经元细胞的凋亡以及变性坏死是PD的一个重要发病机制，那么如何抗凋亡必然成为缓解PD发病的重要关注点。PCBP1属于核不均一核糖核蛋白亚家族的一个成员，可在各种分子水平上参与基因表达的调控：如DNA复制与转录，mRNA向胞核内转入与转出，mRNA翻译和稳定性的调控，并且可参与蛋白与核酸及蛋白与蛋白之间的相互作用[4，5]。已有研究表明，PCBP1参与肿瘤发生、发展，病毒基因表达，铁转运等方面的调控作用。目前，PCBP1在神经系统疾病发生、发展中的调控作用逐渐受到关注。有研究表明PCBP1与神经纤维的发育有密切关系，随着轴突的发育成熟，轴突细胞骨架成熟及轴突口径增加可能与NF-M mRNA稳定性提高有关，而该稳定性增加源于PCBP1的KH同源域识别NF-M 3′-UTR的CU富含位点，进而促进NF-M mRNA水平增加、轴突成熟[6]。

图2 不同浓度6-OHDA对实验组和对照组细胞作用24h后细胞凋亡率的流式分析A～C为对照组细胞;A.5μmol/L 6-OHDA;B.15μmol/L 6-OHDA;C.25μmol/L 6-OHDA；D～F为实验组细胞;D.5μmol/L 6-OHDA;E.15μmol/L 6-OHDA;F.25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞

表2 25μmol/L 6-OHDA作用不同时间后的两组细胞凋亡率比较

对照组为转染空质粒pEGFP/N1的SH-SY5Y细胞；实验组为转染重组质粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y细胞。实验组与对照组比较，P<0.05

图3 25μmol/L 6-OHDA对两组细胞作用不同时间后细胞凋亡率的流式分析A～C为对照组细胞;A.6-OHDA作用8h;B.6-OHDA作用16h;C.6-OHDA作用24h；D～F为实验组细胞;D.6-OHDA作用8h;E.6-OHDA作用16h;F.6-OHDA作用24h；其中右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞

PCBP1可参与细胞增殖、凋亡及周期变化等生物学事件。本课题研究者通过动态贝叶斯网络分析发现，PCBP1可调控7个转录因子的活性和表达。其中，一部分转录子可参与细胞周期及凋亡的调节，如TP53、FOS、FST[7]。另外，将PCBP1转染神经元细胞系SH-SY5Y细胞后，与转染对照质粒的细胞比较，细胞一定程度上加速生长，提示PCBP1对神经细胞的生长发育有一定的调节作用[8]。Nishimura等[9]研究发现PCBP1与ORF57相互作用可提高脊髓灰质炎病毒内核糖体进入位点(internal ribosome-entry site,IRES)的转录，以及X相关的凋亡抑制子(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)活性。在脊髓灰质炎病毒中，ORF57表达增加时，XIAP活性可伴随提高。因此，PCBP1可通过与ORF57相互作用，而参与病毒基因的调节。那么，6-OHDA是一种神经毒素,可致细胞凋亡/死亡,是构建帕金森病细胞/动物模型常用的一种毒素，PCBP1对6-OHDA作用的神经细胞凋亡是否有影响，具体影响到什么阶段是本项研究的关注点。研究经流式细胞仪分析发现，不同浓度的6-OHDA对SH-SY5Y细胞作用24h后，实验组与对照组比较，细胞早期凋亡率明显较低(P<0.05)。同等剂量的6-OHDA对SH-SY5Y细胞作用不同时间后，实验组较对照组细胞的早期凋亡率明显较低(P<0.05)，提示在细胞早期凋亡阶段，PCBP1可以起到一定程度的抗凋亡作用。

然而，本研究中不同浓度的6-OHDA作用相同时间以及同等剂量6-OHDA作用不同时间均显示实验组和对照组的细胞晚期凋亡率比较，差异无统计学意义。提示神经病变细胞进入晚期凋亡后，PCBP1的参与仍然无法抗衡细胞凋亡的结局，研究神经元变性细胞早期凋亡阶段，PCBP1提高细胞抗凋亡能力的调控机制和调控作用，将对于PD等神经变性病的发生、发展及预后具有一定的意义。