生物素及膜偶联间歇透析发酵对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

张玉富，熊海波，徐庆阳1,2,*，陈宁1,2,

1(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室(天津科技大学)，天津，300457) 2(天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室(天津科技大学)，天津，300457) 3(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)

常见的20种氨基酸中，L-亮氨酸(L-Leu)与L-异亮氨酸、L-缬氨酸称为分支链氨基酸[1]。3种分支链氨基酸的生物合成途径，部分共享相同的前体物质和酶[2]。L-Leu在医药、动物饲料、食品、化妆品等领域有广泛应用[3]。有文献报道L-Leu在刺激肌肉蛋白合成和维持葡萄糖稳态中具有重要作用[4]。L-Leu也被用作一种调味剂和片剂生产的润滑剂[5]。与其他大部分L-氨基酸的生产相似，微生物发酵法是当前工业生产L-Leu的主要方法[6]，发酵生产L-Leu的菌种主要是谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌[7]。

生物素是所有生物体都需要的水溶性维生素，因为它在糖异生、脂肪酸合成、氨基酸分解等代谢途径中的羧化反应中扮演着不可或缺的角色[8]。LI等[9]在初始培养基添加适量生物素，发酵中期补充一定量生物素，显著提高了α-酮戊二酸的产量。由于生物精炼过程中生物素保持稳定，玉米秸秆水解液中生物素含量高，Corynebacteriumglutamicum产谷氨酸量极少[10]。生物素不足，抑制谷氨酸棒杆菌的生长，而生物素过量影响谷氨酸的分泌[10-12]，生产过程通过添加Tween[13]、青霉素[14]、乙胺丁醇[15]或者控制温度[16]提高谷氨酸的产量。生物素对Corynebacteriumglutamicum生长状态及产谷氨酸影响机制已被报道[17-18]。生物素对黄色短杆菌产L-Leu的影响未见报道，本文考察了不同浓度生物素对L-Leu发酵的影响，并运用膜偶联间歇透析发酵技术，使L-Leu产量、糖酸转化率显著提高，副产物L-丙氨酸(L-Ala)含量减少。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)TK0303(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr)，天津科技大学代谢工程研究室保藏。

1.1.2 培养基

见参考文献[19]。

1.1.3 主要仪器

发酵罐(5、30 L全自动发酵罐)，上海保兴生物设备工程公司；SBA-40C生物传感仪，山东科学院生物研究所；pH电极、溶氧电极，METTLER TOLEDO；LC20AT高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；TU 1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器；FA2204B电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 培养方法

1.2.1 接种量对摇瓶分批发酵黄色短杆菌产L-Leu的影响

用接种环取1环斜面活化菌种，接种于锥形瓶，31 ℃，200 r/min振荡培养16 h，作为种子液。按照2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%接种量分别接种于发酵培养基中，31 ℃，200 r/min振荡培养，氨水调节pH值至7.0，每个处理进行3个平行实验。检测培养44 h后不同接种量下L-Leu的浓度。

1.2.2 种子培养

吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面中，将菌悬液接入5 L种子罐中，初始通气量1 L/min；搅拌转速300～700 r/min；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度31 ℃；以泡敌消泡；培养16 h后，按一定接种量接入发酵培养基中。

1.2.3 30 L发酵罐分批发酵

按摇瓶分批发酵最适接种量将种子液接入30 L发酵罐中；初始通气量2 L/min；搅拌转速500～800 r/min；通过自动流加氨水控制pH值在7.0；培养温度31 ℃；以泡敌消泡；发酵过程中，葡萄糖按一定的流加方式补入；发酵周期44 h[20]。发酵培养基中，添加20、50、80、120 μg/L生物素，通过四联发酵罐同时进行分批补料发酵，重复3个批次。

1.2.4 膜偶联间歇透析发酵

见参考文献[21]。

1.3 分析方法

1.3.1 菌体浓度测定

每隔4 h取适量发酵液，灭菌生理盐水适当倍数稀释，通过分光光度计测定600 nm波长下吸光度。

1.3.2 溶氧及pH值测定

在线测定。

1.3.3 葡萄糖浓度

取适量发酵液12 000 r/min离心5 min，取上清液稀释适当倍数，用生物传感仪测定。

1.3.4L-Leu及L-Ala浓度

发酵液中L-Leu/L-Ala浓度用高效液相色谱法分析测定[19]。采用Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)色谱柱，衍生剂为2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流动相为50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸钠溶液，柱温33 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm。

2 结果与讨论

2.1 接种量对摇瓶分批发酵黄色短杆菌产L-Leu的影响

通过摇瓶分批发酵实验，考察了不同接种量对L-Leu产量的影响，结果如图1所示。接种量为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%时，发酵终点L-Leu的产量分别为13.3、15.0、15.8、18.2、22.5、21.0、20.5 g/L。其中接种量为10%时，L-Leu的产量最高，而接种量过高或者过低均不利于黄色短杆菌生产L-Leu。

图1 接种量对L-Leu发酵的影响Fig.1 Effect of different inoculum size on L-Leu fermentation

2.2 生物素浓度对L-Leu生产菌的菌体生长、耗糖及产量的影响

生物素作为酶的组成成分，参与机体的三大营养物质——糖、脂肪和蛋白质的代谢，是生物体不可缺乏的重要营养物质之一。在白色链球菌发酵中期加入适量生物素，能显著提高ε-聚赖氨酸的产量[22]。微生物发酵生产谷氨酸，生物素初始浓度对异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶的转录水平及谷氨酸分泌影响很大[23]。限制培养基生物素浓度，酰基CoA羧化酶活性降低，影响脂肪酸和分枝酸合成，细胞膜通透性增加，促进C.glutamicum分泌L-谷氨酸[24]。在发酵培养基中分别添加20、50、80、120 μg/L生物素，每隔4 h测定菌体浓度、糖浓度、L-Leu浓度，结果如图2。

A-菌体浓度；B-残糖含量；C-L-Leu产量图2 不同浓度生物素对L-Leu发酵的影响Fig.2 Effect of different concentrations of biotin on L-Leu fermentation

当生物素浓度提高，L-Leu生产菌能快速繁殖，较快进入生长稳定期。随着生物素浓度升高，菌体浓度也高。添加20、50、80、120 μg/L生物素，发酵液稀释20倍，菌体浓度OD600分别能达到1.59、1.67、1.71、1.74。高浓度生物素使得糖代谢速率加快，加入120 μg/L生物素，16 h后发酵液残糖浓度即低于10 g/L，加入20、50、80 μg/L生物素，发酵液残糖低于10 g/L的时间相对滞后。生物素质量浓度为20、50、80、120 μg/L，发酵终点L-Leu的质量浓度分别为36、60、51、45 g/L。生物素浓度对菌体生长和L-Leu的积累都有影响。生物素浓度过高或者过低，L-Leu的产量均低，这与谷氨酸的发酵生产规律一致[11, 25]。

2.3 不同生物素浓度对L-Leu生产菌转化率、副产物L-Ala的影响

通过高效液相色谱测定了不同生物素浓度下，不同时间点的L-Leu及副产物L-Ala的浓度，计算L-Leu的糖酸转化率，结果如图3所示。发酵液中生物素质量浓度为20、50、80、120 μg/L，转化率分别为19%、22%、18%、15%，副产物L-Ala的质量浓度分别为7、8、11、15 g/L。添加高浓度的生物素，副产物L-Ala随之增加。当生物素质量浓度为50 μg/L时，糖酸转化率最高，谢希贤等[26]通过定向选育得到L-Leu高产菌，糖酸转化率相近。丙酮酸是分支链氨基酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是L-缬氨酸的直接前体物，也是L-亮氨酸的间接前体物。此外，丙酮酸也可以与谷氨酸在谷-丙转氨酶的作用下形成丙氨酸，此反应过程是可逆的，且无反馈抑制效应。添加较低浓度的生物素，副产物L-Ala浓度也低，可能是低浓度的生物素使得丙酮酸生成丙氨酸的反应减弱。

A-糖酸转化率；B-L-Ala的生成量图3 添加不同浓度生物素，对糖酸转化率、副产物L-Ala生成的影响Fig.3 Effect of adding different concentrations of biotin on the glucose conversion rate and the formation of by-product L-Ala, the glucose conversion rate and the yield of L-Ala

2.4 膜偶联间歇透析发酵研究

膜偶联间歇透析发酵工艺，即在普通发酵的基础上，将发酵罐与陶瓷膜相偶联，发酵一定时间后，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将透析滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加透析培养基继续发酵[27]。此工艺能有效解除胞内产物的反馈调节作用及有毒害副产物的抑制作用，促使产酸增加，产酸速率提高。户红通等[21]采用膜偶联间歇透析发酵工艺，谷氨酸产量提高了94.6%，糖酸转化率提高了3.5%。当生物素添加量为50 μg/L时，L-Leu的产量最高，而副产物L-Ala相对较高。为降低L-Leu后续处理难度，提高产品纯度，采用膜偶联间歇透析发酵工艺在不同时间点测定L-Leu与L-Ala产量及对比结果，如图4所示。

A-普通发酵工艺; B-膜偶联间歇透析发酵工艺图4 普通发酵工艺与膜偶联间歇透析发酵工艺L-Leu与L-Ala的产量Fig.4 Production of L-Leu and L-Ala by common fermen-tation process and membrane coupled intermittent dialysis fermentation process

普通发酵工艺，发酵终点L-Leu的产量为60 g/L，副产物L-Ala的质量浓度为8 g/L，且发酵36 h后L-Ala的生成速率增大。采用膜偶联间歇透析发酵工艺，发酵36 h，L-Leu的产量为54 g/L，L-Ala的产量为1.8 g/L，膜过滤透析，补加透析培养基继续发酵20 h，发酵终点L-Leu的产量为36 g/L，L-Ala的产量为2.3 g/L。此外，对2种发酵工艺的总产量、糖酸转化率及产率进行比较，结果如图5。

A-糖酸转化率、副产物、总产量;B-产率图5 糖酸转化率、副产物、总产量(A)及产率(B)的比较Fig.5 Comparison of glucose conversion rate, by-products, total production (A) and production rate (B)

普通发酵工艺，30 L发酵罐L-Leu的总产量约为1 200 g，糖酸转化率为22%，而膜偶联间歇透析发酵工艺L-Leu的总产量约为1 400 g，糖酸转化率为25%，分别提升16.7%、13.6%。采用膜偶联间歇透析发酵工艺，发酵36 h之前(透析前)，与普通发酵工艺的产率相近，其中26 h的产率最高，接近3 g/(L·h)，而36 h后，可以快速达到较高的产率。采用膜偶联间歇透析发酵工艺，能降低发酵液L-Leu浓度，减轻其对L-Leu合成途径关键酶的反馈抑制和反馈阻遏，去除了有害代谢产物，提高了糖利用率，而且透析后进一步提升了L-Leu的生产效率。通过透析处理降低了副产物L-Ala的浓度，降低后续分离提纯L-Leu的难度。

3 结论

本文以黄色短杆菌为研究对象，分析了培养基不同生物素的浓度对L-Leu发酵生产的影响。结果表明，生物素浓度高，菌体生长快、菌体量大，生物素浓度过低，菌体生长慢、菌体量少，不利于L-Leu的生成。通过控制生物素浓度，调节细胞膜通透性[28]，使L-Leu非积累型细胞向L-Leu积累型细胞转变。当生物素浓度升高，副产物L-Ala的浓度随之升高，生物素浓度为120 μg/L，L-Ala浓度比生物素质量浓度为50 μg/L时高87.5%。生物素添加量为50 μg/L时，L-Leu的产量为60 g/L，糖酸转化率为22%。在最适生物素浓度下，采用膜偶联间歇透析发酵，L-Leu的总产量较普通发酵工艺提高了16.7%，糖酸转化率为25%，提高约13.6%。透析后可以使得产酸速率提高，有效降低了副产物L-Ala浓度。本研究为工业化高产L-Leu发酵提供理论依据。