四种菊科蒿属植物精油杀螨活性及茵陈蒿挥发油成分分析

赵娜娜，路 伟，傅文佳，古丽米热·艾买提，杜书亚

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐，830052)

0 引 言

【研究意义】2017 年新疆棉花播种面积 228.11 ×104hm2，其种植面积约占全国种植面积的 70% 以上[1]。影响新疆棉花生产的棉花害虫多达50多种，是导致棉花产量损失的主要原因之一，其中，自20世纪90年代至今，蚜虫、棉叶螨、棉铃虫仍然是影响新疆棉花生产的三大害虫，未得到有效的控制。土耳其斯坦叶螨是北疆棉花害螨优势种群[2,3]，据统计，在新疆100×104hm2棉花中, 每年受棉叶螨为害的达53.33×104hm2，绝收1.33×104hm2，棉叶螨使棉花减产达10%～68%，给棉花生产带来很大的影响[4, 5]。土耳其斯坦叶螨T.turkestani属真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae、叶螨属Tetranychus，主要分布于俄罗斯、哈萨克斯坦、美国、中东和中国等地，在中国仅分布于新疆地区，其他地区还未见报道[6-9]。【前人研究进展】目前国内外防治土耳其斯坦叶螨的主要手段依然是化学防治，主要以有机磷类、新型抗生素类和菊酯类农药杀螨剂对土耳其斯坦叶螨进行防治，土耳其斯坦叶螨繁殖速率快、世代周期短，短期内对一些常用杀虫剂可以产生强抗性，也成为制约新疆农业生产发展的关键因子[10]。筛选出高效、低毒、对环境友好的新型生物农药，研究生物杀螨剂对棉叶螨的防治效果和毒力，不仅对棉田杀螨剂的合理使用具有指导意义，还对于园艺植物替代药剂，绿色产品、无公害产品害螨防治具有参考价值[11]。【本研究切入点】植物源农药是一类来源于植物体的农药，其有效成分通常不是单一化合物。因其对环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性、种类多、开发途径多等特点，在世界范围内引起广泛关注[12]。目前，在我国研究比较深入的杀虫植物中，具有代表性的就属菊科植物，其中蒿属植物更是其中的佼佼者之一。蒿属(Artemisia)是菊科(Compositae)黄春菊族(Anthemideae)的一个大属，该属在世界分布约300多种，其中黄花蒿、野艾蒿、毛莲蒿、猪毛蒿、茵陈蒿、大籽蒿、一枝蒿等具有杀虫、杀菌的活性，有开发为天然产物的潜力。研究4种蒿属植物黄花蒿、茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿精油对土耳其斯坦叶螨的生物活性。【拟解决的关键问题】通过水蒸气蒸馏法提取植物精油，叶片浸渍法测定上述4种植物精油对土耳其斯坦叶螨的毒力，评价不同精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性，为植物源杀螨剂的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

萎蒿、茵陈蒿、黄花蒿分别采集自江苏、陕西、河南，一枝蒿采自新疆维吾尔自治区。所有植物标本保存于新疆农业大学农学院昆虫系天然产物与化学生物学实验室。

1.1.1 植物

蒌蒿、茵陈蒿、黄花蒿分别采集自江苏、陕西、河南，一枝蒿采自新疆维吾尔自治区。所有植物标本保存于新疆农业大学农学院昆虫系天然产物与化学生物学实验室。表1。

表1 4种植物名录
Table1 Four plants directory

种类Species拉丁名scientific name科名Family采集部位Source黄花蒿Artemisia annua Linn.菊科全草蒌蒿Artemisia selengensis Turcz.ex Bess菊科全草一枝蒿Artemisia rupestris L.菊科根茎茵陈蒿Artemisia capillaries Thunb.菊科全草

1.1.2 土耳其斯坦叶螨

供试虫源：土耳其斯坦叶螨于2017年6月采自新疆沙湾县棉花田的自然种群，采集前棉田未施用任何药剂。将采集的棉叶螨接到室内种植的盆栽棉花上，等饲养至下一代后再挑选同一批次羽化的成虫，挑选大小一致的成螨作为试虫，试虫不分雌雄。

饲养条件：接种后的盆栽棉花置于人工气候箱内，气候箱设置温度(26～28)℃，相对湿度为75%，光照黑暗时间为14 h∶8 h(L∶D)。

1.1.3 试剂与仪器

仪器：连续蒸馏装置，北京玻璃仪器厂；DZTW型调温电热套，北京市永光明医疗仪器有限公司；SHZ-DIII循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器有限责任公司；RE-52CS型号旋转蒸发器，上海振捷实验设备有限公司； FA2004N电子天平，天津天马衡基有限公司；PSX-280H恒温恒湿箱，宁波莱福科技有限公司。

化学试剂：正己烷、丙酮、无水硫酸钠(分析纯)均购自天津化学试剂公司；聚四氟乙烯购于上海三爱富公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取植物精油

通过水蒸汽蒸馏法提取黄花蒿、茵陈蒿、蒌蒿、一枝蒿精油，提取方法如下：取0.5 kg植物一次全部放入到3 000 mL的圆底烧瓶，加2 000 mL水，用水蒸气蒸馏法蒸馏3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用无水硫酸钠脱水后，用旋转蒸发器减压蒸发浓缩(40℃)回收正己烷，所得残留的油状液即为精油，测比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 触杀活性测定

实验配制浓度为2%的琼脂，将加热后的琼脂倒入12孔的培养板内，琼脂高度约为0.5 cm，置于-4℃冰箱内备用。将田间采集未施药剂的新鲜棉花叶片洗净晾干，用直径为2 cm的打孔器打孔待备用；以丙酮为溶剂配制2 mL浓度为50%、10%、2%、0.4%的药剂，棉花叶片在溶液中浸泡10 s后，用镊子夹出，置于滤纸上自然挥发2 min，然后叶背朝上置于已倒好的琼脂上，挑取10头健康一致的成虫于叶片上，宣纸盖在培养板上，固体胶封好，置于温度为25 °C、湿度为70%的温箱内。24 h后，观察和记录试虫的死亡情况。每个浓度重复5次，每个重复10头试虫，丙酮不加药剂作空白对照。用毛笔拨动虫体，虫体不动即为死亡。

根据预实验的结果，在死亡率为0～100%的浓度范围内选取6个浓度，方法同预试验，每个浓度重复5次。

死亡率(%)=100×死虫数/试虫数。

校正死亡率(%)=100×[处理组死亡率-对照组死亡率/(1-对照组死亡率)]。

半致死浓度(LC50)即引起50%土耳其斯坦叶螨死亡率的浓度，使用Probit软件包计算得到半致死浓度。

1.2.3 GC-MS测定精油化学成分

样品送至北京师范大学分析测试中心。

采用美国Bruker公司450 GC-320 MS三重四级杆气质联用仪，配备BP-5MS石英毛细管色谱柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI离子源温度210℃；传输线温度250℃；进样口温度250℃；进样量1验μL，分流比1∶10。升温程序：起始温度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升温至290℃，停留15 min。

2 结果与分析

2.1 生物活性

研究表明，在药剂浓度为60.00 mg/mL时，蒌蒿、茵陈蒿、一枝蒿精油的致死率均高达100.00%，黄花蒿的致死率分别为52.00%，活性相对较弱；在浓度为40 mg/mL时，茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿精油的致死率高达90.00%、90.00%、84.00%，黄花蒿的活性较弱，致死率为24.00%；在浓度为26.70 mg/mL时，茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿的致死率分别高达86.00%、80.00%和68.00%，黄花蒿的致死率依然最低为20.00%；在浓度为18.30 mg/mL时，茵陈蒿、一枝蒿精油的致死率分别为48.00%、46.00%，蒌蒿的致死率分别为26.00%黄花蒿的活性较弱，致死率仅为4.00%；在浓度为11.70 mg/mL时，活性较好的茵陈蒿、蒌蒿，致死率分别为18.00%、16%，黄花蒿无活性；在浓度为8.00 mg/mL时，仅有茵陈蒿、一枝蒿有较弱活性，致死率分别为20.00%、16.00%。表2

表2 4种精油处理土耳其斯坦叶螨24 h后校正死亡率
Table 2 Correct mortalityof the four essential oils againstT.turkestaniadults after 24 h(%).

药剂Species60.00 mg/mL40.00 mg/mL26.70 mg/mL18.30 mg/mL11.70 mg/mL8.00mg/mL黄花蒿52.00±4.90b24.00±2.45d20.00±0.00c4.00±2.45c0.00c0.00c一枝蒿100.00a90.00±3.16a80.00±3.16a46.00±5.10a14.00±4.00ab16.00±4.00ab茵陈蒿100.00a90.00±3.16ab86.00±4.00a48.00±3.74a18.00±3.74a20.00±0.00a蒌蒿100.00a84.00±2.45bc68.00±3.74b26.00±2.45b16.00±6.00a8.00±4.89bc

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著

Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性较好，LC50分别为17.49、18.17、22.26 mg/mL，与阳性对照除虫菊提取物触杀活性(LC50=4.12 mg/mL)相比相差在10倍以内；黄花蒿精油的触杀活性最弱，LC50为54.00 mg/mL，是阳性对照除虫菊提取物的13.11倍。表3

表3 4种精油对土耳其斯坦叶螨触杀活性
Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils againstT.turkestaniadults.

药剂SpeciesLC50 (mg/mL)95% 置信区间 (mg/mL)95% Confidence intervals (mg/mL)Slope±SE黄花蒿54.0048.20-61.593.703±0.401蒌蒿22.2618.93-27.083.255±0.348茵陈蒿17.4914.17-20.044.232±1.025一枝蒿18.1716.04-20.483.700±0.357除虫菊提取物4.122.70-6.530.823±0.149

2.2 茵陈蒿精油的化学成分

茵陈蒿精油通过GC-MS检测并鉴定出33个峰，其中出峰时间在17.46 min时的物质含量最高。研究表明，茵陈蒿精油化学成分及相对含量大根香叶烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-毕橙茄醇(7.03%)、依兰油醇(4.83%)等。图1，表4

图1 茵陈蒿精油离子谱
Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from A.capillaries

3 讨 论

菊科植物中有多数高活性植物，其中蒿属植物更是其中的佼佼者之一，如Tonk等[13](2006)分别提取了黄花蒿的石油醚部分和正己烷部分，并测定黄花蒿提取物对斯氏按蚊3龄幼虫的生物活性，结果表明，黄花蒿提取物的效果较好。韩小冰等[14](2011)对大籽蒿、黄花蒿、猪毛蒿对舞毒蛾具有较强的触杀作用。王宇新[15](2009)测定了黄花蒿精油和猪毛蒿精油对玉米象成虫的生物活性，结果表明，在触杀活性测定中，0.5 μL/头处理24 h后，黄花蒿精油和猪毛蒿精油对试虫的校正死亡率分比为96.66%、97.77%，表现了较高的触杀活性；在熏蒸活性测定中，两种精油表现了较高的熏蒸活性，83.33 μL/L处理48 h后，试虫的校正死亡率均为65%以上；在驱避活性测定中，两种精油对玉米象成虫均有良好的驱避作用，8 μL处理24 h后，趋避活性为Ⅳ级。袁海滨等[16](2007)测定了猪毛蒿、黄花蒿、水蒿、大籽蒿4种植物精油对绿豆象成虫的杀虫活性，结果表明，这4种植物精油均对绿豆象有较好的熏蒸剂触杀活性。谢怡孙等[17](2001)测定了蒌蒿精油对菜青虫具有较强的拒食和胃毒作用。Liu等[18]测定了一枝蒿精油对嗜卷书虱的趋避活性、触杀活性和熏蒸活性，并以生物测定为指导分离纯化出松油醇、乙酸松油脂、4-松油醇和芳樟醇4种活性化合物。茵陈蒿、蒌蒿、黄花蒿、一枝蒿4种蒿属植物多集中在杀虫活性方面，还未有文献报道其杀螨活性。

表4 茵陈蒿精油的化学成分
Table 4 The chemical constituents of the essential oil derived fromA.capillaries(≥1.00%)

序号Number保留时间(RT)Retention Time化合物Compounds相对含量(%)Peak area (%)19.26β-蒎烯 (.beta.-Pinene)1.00310.68罗勒烯(1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-)1.00411.67芳樟醇(1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-)1.30616.67石竹烯(Caryophyllene)8.70716.96(E)-β-金合欢烯( 1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3-methylene-, (E)-)1.34817.14α-石竹烯(.alpha.-Caryophyllene)1.19917.34可巴烯(Copaene)3.681017.382-甲基-6-对甲苯基-2-2-庚烯醇(6-(p-Tolyl)-2-methyl-2-heptenol)1.261117.46大根香叶烯 D(1,6-Cyclodecadiene, 1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-, [s-(E,E)]-)16.161217.61联二苯(Biphenyl)3.181317.641,1-二甲基-二丁基-2,2,3,3-四氟丙基磷酸酯(Phosphoric acid, dibutyl 1,1-dim-ethyl-2,2,3,3-tetrafluoropropyl ester)4.431518.33氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)10.421618.65桉油烯醇((-)-Spathulenol)3.301719.41依兰油醇(tau.-Muurolol)4.831819.55a-毕橙茄醇(.alpha.-Cadinol)7.032019.78环氧异香树烯(Isoaromadendrene epoxide)1.592220.842-甲基-4-(2,6,6-三甲基环己烯基)2-丁烯-1-醇(2-Methyl-4-(2,6,6-tri-methylcyclohex-1-enyl)but-2-en-1-ol)1.04总含量74.52

根据研究结果表明：茵陈蒿和一枝蒿精油对土耳其斯坦叶螨具有较好的触杀活性，其LC50值分别为17.49、18.17 mg/mL，活性虽弱于阳性对照，但与阳性对照除虫菊提取物(LC50=4.12 mg/mL)相比，活性相差在10倍以内，表明茵陈蒿和一枝蒿具有较好的杀螨活性。且有文献表明茵陈蒿对玉米象有熏蒸活性，其LC50分别是5.31和7.35 mg/L，同时也表现出触杀活性，其LD50分别是105.95和87.92 μg/头[19]。表明茵陈蒿精油具有较好的杀螨活性和杀虫活性，具有发展为天然农药的潜力。

茵陈蒿A.capillaries为菊科、蒿属植物，有特异的香气，味微苦，主产江西、江苏、安徽、湖北、浙江、陕西、河北、山东等省；为治肝、胆疾患的主要成分，水提取液对多种杆菌、球菌有抑制作用，挥发油有抗霉菌的作用[20]。研究测得茵陈蒿精油的主要化学成分为大根香叶烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)和石竹烯(8.70%)a-毕橙茄醇(7.03%)/依兰油醇(4.83%)。这几种主要成分有可能是关键的杀螨活性成分，但还有待进一步分离纯化，验证生物活性。关键的化学成分则可以杀螨剂的合成提供先导化合物，为植物源农药的进一步开发应用提供依据。

目前国内外对于植物源药剂防治棉叶螨的研究较多，大都集中在朱砂叶螨、二斑叶螨的生物活性研究方面，仅有一篇外文文献报道了迷迭香、薄荷等精油及其主要化学成分对土耳其斯坦叶螨的熏蒸活性[21]。有必要进一步开发植物资源，为土耳其斯坦叶螨的生物防除提供理论依据，为植物源杀螨剂的研制提供技术数据。

4 结 论

4种参试菊科蒿属植物中，茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿精油对土耳其斯坦叶螨具有较好的触杀活性，其中茵陈蒿的活性最好，稍弱于除虫菊提取物，有发展为天然杀螨剂的潜力。茵陈蒿精油通过气相色谱-质谱联用仪分析，主要成分为大根香叶烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-毕橙茄醇(7.03%)、依兰油醇(4.83%)。