棉秸秆自然腐解过程中细菌菌群多样性分析

王志方，陈竞，代金平，古丽努尔·艾合买提，王小武，秦新政，李晨华，杨新平

( 1.新疆农科院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2.中科院新疆生态与地理研究所，乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】新疆是我国最大棉花主产区和重要商品棉生产基地，棉花秸秆资源丰富[1]，棉花秸秆中富含 N、P、K等多种营养元素，对资源化利用、现代农业可持续发展均具有重要意义[2]。棉秸秆木质化程度和C/N比均较高[3]，其资源化利用水平低下；新疆土地较贫瘠，若将棉秸秆直接还田，不仅在短时间内难以腐熟[3]，而且易导致C/N比失衡，引起还田秸秆在腐解前期与作物争氮，影响土壤微生态环境[4]。大部分棉秸秆随意堆置或原位焚烧，微生物在秸秆腐解和养分释放过程中具有举足轻重的作用[5]，秸秆降解微生物群落功能多样性的研究显得尤为重要。【前人研究进展】主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，是通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构。基于Weighted Unifrac距离来进行PCoA分析，如果样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此，群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。秸秆发酵/腐解是多种微生物菌群共同作用的结果，并依赖于外部因素进行自我调控的复杂生化过程[6]。尉良[7]发现添加微生物菌剂能有效促进发酵过程中有机物质的分解，加快发酵腐熟进程，能在一定程度上提高发酵产品的肥效；慕永红等[8]发现，利用MTS酵素可以加速秸秆腐烂速度，促进秸秆中营养元素的释放，在生物菌剂的作用下，秸秆中速效磷大量释放期可以提前一个月，以及速效钾释放量增加1倍[9]。目前，自然界中存在的某些细菌、放线菌和真菌等均具有降解秸秆特性，其中因放线菌和细菌产酶含量低，且二者多产生胞内酶，难于分离，故不易大规模生产。在工业生产中，主要利用Trichoderma．sp 和Aspergillus．sp 用于降解秸秆。还有研究表明，Coriolus.sp、Poria．sp、Phanerochaete.sp、Sjekandera.spPenicillium.sp 、Acremonium．sp、Myrothecium.sp、Neurospora．sp 、Chaetomium．sp等菌株对秸秆也具有较高的分解能力[10-12]。 【本研究切入点】由于秸秆腐解的快慢与秸秆自身组成、微生物种类和所处的环境有关。不同种类的秸秆其大小、C/N ,物质组成比例及周围的环境条件各不相同，导致秸秆腐解的速度亦有差异[13]。目前关于棉秸秆降解菌群的报道较少。研究利用微生物学和分子生物学手段筛选和鉴定棉秆自然腐熟过程中的微生物菌群。【拟解决的关键问题】基于高通量测序技术，研究棉秸秆腐解过程中微生物菌群变化，为筛选棉秸秆高效腐熟菌剂，加快棉秸秆腐解过程，提高棉秸秆还田及基质化利用效率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秸秆

于2017年分别采自新疆吐鲁番棉花产区，用曼大LYS550秸杆粉碎机将棉秆粉碎成 1～2 cm长度备用。称取自然风干棉秸秆8 kg，加入自来水拌匀至含水量为60%，堆成直径80 cm，高度60 cm的小堆，表面覆盖塑料布，在通风的室内进行堆制，室温在20～28℃范围内，间隔7 d取样，持续采样4次。

1.2 方 法

1.2.1 棉秸秆自然堆制过程中菌群16S rDNA高通量测序1.2.1.1 基因组DNA提取

采用 CTAB 或 SDS 方法对样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

1.2.1.2 PCR引物设计及扩增

根据所扩增的16S区域特点，基于Illumina HiSeq测序平台，选取16S V4区引物(515F：GTGYCAGCMGCCGCGGTAA和806R：GGACTACNVGGGTWTCTAA)，与 其它片断组合成5’Hiseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’的PCR扩增引物，使用New England Biolabs 公司的 Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR扩增。扩增条件为94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s。循环25次；72℃ 5 min。

1.2.1.3 文库构建和高通量测序

使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.2.2 测序数据

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列参照Qiime(V1.7.0)构成Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。 经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过(UCHIME Algorithm)与数据库(Gold database)进行比对 检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。

1.2.3 序列1.2.3.1 操作分类单元聚类和物种注释

利用Uparse 软件(Uparse v7.0.1001)[14]对所有样品的全部 Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，同时选取OTUs的代表性序列，用Mothur方法与SILVA[15]的SSUrRNA数据库[16]进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平，统计各样本的群落组成。

1.2.3.2 样品复杂度

使用Qiime软件(Version 1.7.0)计算Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage 指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线，使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析。

1.3 数据处理

数据均以平均值±标准偏差来表示，运用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 高通量测序

研究表明，5个样品的有效序列数在6万到9万之间，在97%相似水平下对所有序列进行OUT划分，OUT数量在200～600。表1

各样品goods-coverage指数接近0.97，测序深度已经基本能覆盖该微生物群落中绝大多数细菌。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种(OTUs)，稀释曲线趋于平缓，结合goods coverage指数，各样品文库中包含了棉秸秆堆制过程中的绝大多数细菌类群，基本能够反映群落组成，增加更多的测序数据量，只会产生很少量的新的OTU。表2,图1

表1 棉秸秆自然腐解过程中不同时期样品高通量测序
Table1 Data of the high-through sequencing results of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

样品Sample有效序列总数Total number of valid sequences有效OTU总数Total number of valid OTUsD060 034216D765 857308D1472 610497D2183 071530D2872 495560

表2 棉秸秆腐解过程中不同时间样品微生物群落α多样性
Table 2 α diversity of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

样品SampleGoods coverage indexShannon indexSimpson indexD00.9983.802±0.797 1c0.785 ±0.071 7 bD70.9986.386±0.330 6b0.959±0.014 1aD140.9977.384±0.140 3ab0.985 ±0.001 8aD210.9977.767±0.057 0a0.989±0.000 0aD280.9977.671±0.142 3a0.984 ±0.002 6a

注: 同列不同字母表示0.05水平差异显著

Note: Values followed by different small letters in the same column mean significantly different atP<0.05

2.3 棉秸秆自然堆制菌群多样性

研究表明，堆制7 d后的菌群与初期菌群结构差异明显，而14 d后的菌群结构与7 d时也有所差异。

Alpha多样性指数Shannon、Simpson可以用来估算微生物多样性，数值越大，说明菌群多样性越高，堆制7 d时细菌群落多样性与堆制起始时有显著性差异。堆制后期细菌群落多样性差异不显著。 图2

图1 棉秸秆自然腐解过程中不同时期样品细菌群落稀释曲线
Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

图2 棉秸秆腐解过程中不同时间样品微生物群落主坐标
Fig.2 PcoA of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

2.4 棉秸秆堆制过程中细菌优势属变化

堆制全过程中共测得325个菌属，堆制初期为268个菌属，中期达到 300个菌属，末期菌属为325个，比初期增加21%，堆制后期比初期微生物种类更加丰富。在全过程中始终存在的优势菌属有鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、橄榄球菌属(Olivibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)。在堆制初始阶丰度最高的寡养食单孢菌属(Stenotrophomonas)在堆制过程中持续减少。在堆制中后期成为优势菌属的有短波单胞菌属(Brevundimonas)、Simiduia属、纤维弧菌属(Cellvibrio)。图3

注：黄色表示细菌菌属在腐解过程中一直是优势菌属；红色表示细菌菌在属腐解过程中丰度持续下降；蓝色及紫色表示细菌菌属腐解过程中后期成为优势属

图3 棉秸秆腐解过程中不同时间样品优势菌属
Table 3 Dominant bacterial genus in cotton straw samples from different degradation time

3 讨 论

3.1 棉花秸秆还田具有培肥地力等优势，由于棉秸秆主要成分为纤维素、半纤维素、木质素，还含有单宁、果胶素等，其中木质素含量为36%[17]，比其它主要农作物高2～3倍，造成棉秸秆难以充分腐解，影响播种质量、出苗、作物生长和产量。微生物降解棉秆的过程是在适宜的营养、温度、湿度、通气量和pH条件下，通过微生物增殖，把棉秸秆中碳、氮、磷、钾和硫等分解矿化或形成为简单有机物和腐殖质过程，大部分微生物只能降解其中的一部分，单一微生物所分泌的酶系统很难达到对棉秸秆的快速降解，因此，需要由多种不同降解功能的微生物协同作用来完成棉秸秆的降解。

3.2 目前采用高通量测序技术研究群落组成及变化的报道很少，主要集中在筛选一些具有降解棉秸秆纤维素、半纤维素、木质素功能的微生物菌株。孙美娜等[3]利用微生物学和分子生物学手段筛选和鉴定了棉秆表面附着的真菌，获得4株具有高效纤维素分解能力的真菌。王益等[18]通过对白腐真菌和噬热性侧孢霉拮抗试验、白腐真菌和噬热性侧孢霉复配对棉花秸秆降解的最优条件组合筛选试验、白腐真菌与噬热性侧孢霉复配在田间降解秸秆的系列研究进行分析。侯敏等[19]筛选得到 24 株纤维素降解菌。詹发强等[20]从新疆棉秸秆中筛选到二株耐热真菌，在一定培养条件下对棉秸秆的降解率为53%。但是利用传统的培养方法选择性很小，能够分离到的微生物只有很小一部分，利用高通量测序技术可最大限度的保留微生物群落原有的群落组成和分布特征，可以有针对性地分离具有秸秆降解功能的土著菌。

3.3 为研究棉秸秆在自然腐解过程中菌群变化规律，采用16S rDNA高能量测序技术，对棉秸秆自然堆制过程中的分子生态学进行分析。将腐解过程按照每7 d为一个阶段进行取样分析，共持续28 d。菌群α多样性指数分析显示，随着堆制时间的延长，7 d以后菌群多样性与起始时相比差异显著，而7～28 d菌群多样性差异不显著，说明在自然堆制条件下，7 d后棉秸秆中微生物群落结构进入相对稳定状态。在整个堆制过程中始终存在的优势菌属包括鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、橄榄球菌属(Olivibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)。这些菌属与徐丽萍等(2018)[21]、令利军等(2017)[22]采用高通量测序技术研究降解玉米秸秆降解过程中发现的优势菌群一致，说明这些菌属在秸秆降解过程中起到重要作用。

3.4 菌属功能研究表明，鞘氨醇杆菌属、橄榄球菌属具有降解芳香族化合物功能，假黄单胞菌属同时具有降解芳香族化合物和纤维素功能，而木质素是一类含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物[23]，推测这几类菌属主要作用是降解棉秸秆中的木质素和纤维素。德沃斯氏菌属具有固氮和降解胶质多糖类物质的功能，固氮菌属具有固氮功能。微生物对有机物降解的适宜C∶N为25∶1[24]，过高或过低均会影响微生物对秸秆的分解和秸秆养分的释放。而棉秸秆C∶N在120∶1左右，极度缺乏氮素。推测具有固氮功能的细菌群落在堆制过程中能够提供氮素，促进棉秸秆的降解。在堆制中后期出现的优势菌群短波单胞菌属 、Simiduia属具有降解胶质多糖类物质的功能，有研究显示，经果胶酶处理过的棉秸秆进行腐解[25]，后期的菌落总数与对照相比增长2倍， 推测此类菌群通过降解棉秸秆中的果胶类物质促进秸秆微生物群落的繁殖，促进秸秆的腐解。在堆制起始阶段丰度最高的寡养食单孢菌属随着堆制时间延长，其丰度持续下降，随着腐解过程的进行，棉秸秆在微生物的降解下释放出较多的营养物质，抑制了此类菌属的增殖。

3.5 参与棉秸秆自然腐解过程的细菌种类繁多，优势菌群的功能集中在纤维素、木质素、果胶类物质以及固氮作用。相对真菌，细菌的降解功能较弱，在秸秆降解过程中真菌也具有重要的作用，将继续对棉秸秆降解过程中的真菌群落进行研究，探讨真菌、细菌群落的协同作用，对分离棉秸秆降解微生物菌株，制备棉秸秆高效腐熟剂。

4 结 论

4.1 棉秸秆自然腐解过程中，通过细菌群落α多样性分析、PcoA主成分分析，显示在7 d时细菌群落多样性在属水平上与腐解起始阶段有显著差异，随着腐解时间延长，菌落多样性趋于一致。

4.2 在整个腐熟过程中存在一些优势属，包括鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、橄榄球菌属(Olivibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)，为降解纤维素、木质素、果胶类物质以及提供氮素营养。